Ent faecalis в моче: Enterococcus faecalis ( )

Особенности инфекции мочевой системы у детей, ассоциированной с Enterococcus faecalis, с учетом его биологических свойств Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© Е.А.Мельникова, Е.А.Зайцева, В.Н.Лучанинова, Т.С.Андреева, Н.С.Вайсеро, О.В.Семешина, 2016 УДК [616.6 : 616.9] — 053.32

Е.А. Мельникова1, Е.А. Зайцева2, В.Н. Лучанинова1’2, Т.С. Андреева2, Н.С. Вайсеро1, О.В. Семешина1

ОСОБЕННОСТИ ИНФЕКЦИИ МОЧЕВОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ENTEROCOCCUS FAECALIS, С УЧЕТОМ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

1Краевая детская клиническая больница №1, г Владивосток; 2Тихоокеанский государственный медицинский университет, г Владивосток, Россия

E.A. Melnikovai, E.A. Zaytseva2, V.N. Luchaninovai2, T.S. Andreeva2, N.S. Vayseroi, O.V. Semeshinai

FEATURES OF URINARY TRACT INFECTION IN CHILDREN ASSOCIATED WITH ENTEROCOCCUS FAECALIS IN VIEW OF ITS BIOLOGICAL PROPERTIES

1Regional children’s clinical hospital №1, Vladivostok, 2 Pacific state medical University Vladivostok, Russia

РЕФЕРАТ

В статье дана эпидемиологическая оценка обсеменённости Enterococcus faecalis, описаны его микробиологические особенности, включая факторы патогенности, представлены клинические проявления инфекции мочевой системы у детей, вызванных данным уропатогеном, приведены результаты исследований фенотипических свойств, адгезивной активности и факторов вирулентности мочевых изолятов Enterococcus faecalis.

Ключевые слова: инфекция мочевой системы у детей, Enterococcus faecalis, факторы патогенности.

ABSTRACT

The article presents the epidemiological evaluation by the Enterococcus faecalis features, described microbiological characteristics bacterium, including pathogenicity factors, presented clinical features of the infection of the urinary system in children, caused by uropathogen, results of studies of phenotypic properties, adhesive activity and virulence factors of urinary isolates of Enterococcus faecalis.

Key words: Urinary tract infection in children, Enterococcus faecalis, pathogenicity factors.

ВВЕДЕНИЕ

Инфекционно-воспалительные заболевания мочевой системы у детей многие годы остаются актуальной проблемой педиатрии, детской нефрологии и урологии. Особенностью этих заболеваний является их этиологическая мультифакторность. В течение длительного времени общепризнанными возбудителями уроинфекций считаются грамо-трицательные энтеробактерии, среди которых доминирует Escherichia coli. В последнее время все большее значение в этиологии заболевания приобретают грамположительные кокки, в частности Enterococcus faecalis (E. faecalis). Частота его встре-

Мельникова Е.А. Россия, 690078, г.Владивосток, пр. Острякова, д. 27. Краевая детская клиническая больница №1, краевой детский уронефрологический центр. Тел.: 8(423)295-68-96, E-mail: melnikova. [email protected].

чаемости, как этиологического фактора инфекции мочевой системы (ИМС) у детей, за последние 15 лет увеличилась и составляет, по данным разных авторов, от 5 [1] до 14,2% [2], при нозокомиальной ИМС — от 10 до 16% [3], а у новорожденных детей с ИМС — до 75% [4]. Нозокомиальная инфекция мочевых путей, особенно катетер-ассоциированная, занимает первое место среди всех видов госпитальной инфекции в отделениях интенсивной терапии и реанимации (свыше 40% от всех случаев), часто осложняя течение других неурологических заболеваний [1].

аееаШ среди возбудителей ИМС у детей, его свойства, как уропатогена, недостаточно изучены.

Цель исследования: дать эпидемиологическую оценку обсеменённости БАесаШ и определить его

фенотипические свойства, адгезивность и факторы патогенности в изолятах мочи при инфекции мочевой системы у детей.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось в несколько этапов.

1. Эпидемиологический этап. С целью определения частоты Е.ГаесаШ, как причины ИМС у детей, проанализировано 1300 результатов бактериологических исследований образцов мочи, полученных от пациентов с ИМС в возрасте от 3 дней до 17 лет, находящихся на лечении в отделениях многопрофильной детской больницы (2010-2014 гг.). Одновременно в процессе диагностического (эпидемиологического) поиска путей проникновения Е.

/авеаШ в организм детей с периода новорождён-ности было проанализировано 1136 результатов бактериологических исследований влагалищного секрета у женщин детородного возраста с заболеваниями органов малого таза и 127 результатов бактериологических исследований грудного молока у женщин с лактационными маститами (2011-2013 гг).

2. Клинико-лабораторный этап. В первую очередь необходимо было оценить патогенный потенциал культур Е. /авеаШ [5]. Для определения биологических свойств уропатогена использовали 25 культур Е. /авеаШ, изолированных из мочи детей с ИМС в титре 103—105 КОЕ/мл. Выделение и изучение биологических свойств Е./авеаШ проводилось согласно приказу МЗ СССР №535 от 22 апреля 1985 г. Адгезивную способность энтерококков определяли по методике В.И. Брилис и соавт. (1986) на эритроцитах 0 (I) группы крови Rh (+) [6]. При оценке адгезивных свойств энтерококков использовали средний показатель адгезии (СПА). Он отображает среднее количество микробных клеток, прикрепленных к одному эритроциту.

Ад-

гезивность считается нулевой при СПА от 0-1,0; низкой — при СПА от 1,01 до 2,0; средней — от 2,01 до 4,0; высокой — свыше 4,0. Для оценки клинической картины ИМС и определения связи с биологическими свойствами E. faecalis проведен анализ 149 историй болезни пациентов, находившихся под нашим наблюдением.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием специализированного пакета прикладных программ «SPSS Statistics 12.0» («SPSS Inc: An IBM Company», США). Данные представлены в виде среднего арифметического±стандартное отклонение (M±SD). Проверку гипотез о равенстве двух средних проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При анализе результатов бактериологических исследований мочи выявлено, что удельный вес E. faecalis, как этиологического фактора ИМС, изменялся (в разные годы) от 11,8 до 34,5% в урологическом и нефрологическом отделениях и от 52,9 до 75,0% в отделениях новорожденных. E. faecalis чаще выделялся из мочи девочек с ИМС (60,8±1,4%), чем мальчиков (39,2±1,4%), р<0,001. Но возрастной критерий имел определяющее значение: у детей до 1 года, включая новорожденных, фекальный энтерококк выделялся намного чаще (в 32,7±1,3% случаев), чем в других возрастных группах. У детей в возрасте от 1 года до 3 лет E. faecalis был этиологическим фактором ИМС в 12,5±0,9% случаев, от 3 до 7 лет — в 17,0±1,0%, от 7 до 15 лет — в 29,3±1,3%, старше 15 лет — в 8,5±0,8% случаев. Различия показателей между всеми группами достоверны, р<0,001. Выявлена сезонная зависимость: E. faecalis чаще выделялся

Г /

Распределение выделения E. faecalis по месяцам года.

весной (34, 2%) с осцилляцией в апреле (15, 0%), в зимние месяцы он тестировался в 22,5% случаев, в летний период — в 23%, осенью — в 20,4% (рисунок).

Выявлено, что в 6,0±0,8% случаев фекальный энтерококк одновременно выделялся из мочи и влагалища у девочек, в единичных случаях он обнаруживался одновременно в образцах мочи, полученной обычным путем и из нефростомы, а также из почки интраоперационно. У одного пациента с терминальной стадией почечной недостаточности, находящегося на перитонеальном диализе, E. faeca-lis выделялся из мочи и перитонеальной жидкости в диагностическом титре (105 КОЕ/мл). У 25,9% пациентов выявлены микробные ассоциации E. faecalis с другими уропатогенами, в основном энте-робактериями, чаще (в 19,4±1,0%) с E. coli. Нередко E. faecalis выявлялся в ассоциации с Staphylococcus epidermalis — в 4,9±0,6% случаев. У наблюдаемых нами детей с ИМС E. faecalis был выделен из мочи в монокультуре.

У женщин с заболеваниями органов малого таза E. faecalis определялся во влагалищном секрете от 24,2±2,7% в 2011 г. до 29,4±2,0% в 2013 г. , уступая первенство кишечной палочке (48,0±2,5% и 55,3±2,2% соответственно). Такая же структура патогенов отмечается и при лактационных маститах у женщин, причем удельный вес E. faecalis увеличился с 20,8% в 2011 году до 27,8% в 2013 г. У 14,3±1,9% женщин с заболеваниями органов малого таза E. faecalis выделялся в ассоциации с Candida albicans, в единичных случаях с E.coli и Staphylococcus aureus.

Исследовав биологические свойства Е. faecalis в изолятах мочи детей с ИМС, выявлено, что большинство из них имели однотипные фенотипиче-ские свойства: являлись каталазоотрицательными грамположительными кокками, располагающимися парами или короткими цепочками. Однако при изучении биохимической активности выявилось, что фекальные энтерококки вариабельны по отношению к сахарам. Так, глюкозу ферментировали 39,1±10,4% исследуемых культур, лактозу -42,8±11,0%, сахарозу — только одна культура.

Отмечена вариабельность ферментативной активности факторов, связанных с патогенностью. Исследуемые культуры энтерококков показали неоднородность в протеолитической активности: 73,3±8,0% Е. faecalis ферментировали молоко и 35,0±10,9% разжижали желатину. Гемолитическая активность отмечена у 56,7±9,0% E. faecalis, которая выявлялась двух типов: а- (у 20,0±7,3% культур) и Р-гемолиз (у 36,7±8,8% энтерококков). Лецитиназная активность выявлена у 33,3±9,8%

Е. faecalis и слабая липолитическая активность в отношении твина 20 и твина 80 у 85,0±8,2% изученных культур. При изучении адгезивных свойств отмечено, что все культуры Е. faecalis обладали способностью взаимодействовать с эритроцитами человека. Энтерококков с нулевым и низким уровнем адгезии выявлено не было.

Все исследуемые энтерококки по среднему показателю адгезивности (СПА) были разделены на две группы (таблица). В первую (п=10) вошли Е. faecalis со средним уровнем адгезии (СПА от 2,0 до 4,0), во вторую (п=12) — с высоким показателем адгезии (СПА>4). Отмечено, что у энтерококков со средними показателями адгезии (первой группы) реже выявлялась протеолитическая, лецитиназ-ная, липазная и гемолитическая активности (см. таблицу). Энтерококки с высоким показателем адгезии (второй группы) с большей частотой ферментировали желатин (50,0% культур) и молоко (91,7%), показали тип Р-гемолитической (58,3%), а также лецитиназную (50,0%) и липазную (91,7%) активности.

Выявлено пять культур энтерококков с очень высокой способностью к адгезии (СПА>5,5), у которых определялась ферментативная активность, связанная с патогенностью (протеолитическая, гемолитическая, липолитическая и лецитиназная активности), наличие капсулы. Эти культуры Е. faecalis были выделены в титре 103—105 КОЕ/мл у детей с тяжёлым течением инфекции мочевыводя-щих путей, протекавшей на фоне внутриутробной и неонатальной пневмонии.

Среди клинических проявлений ИМС энтеро-кокковой этиологии у 86,6% пациентов преобладали симптомы интоксикации разной степени выраженности, гипертермия в диапазоне 37,1-39,0 °С была выявлена у 51,7±4% больных, в том числе фебрильная в 40,3% случаев. Другие симптомы имели меньшую выраженность: болевой синдром

Таблица

Факторы патогенности E. faecalis в группах с разными показателями адгезии

Факторы патогенности I группа(n=10) (СПА = 2,01 до 4,0) II группа (n=12) (СПА >4,0)

Ферментация желатины 12,5% 50,0%

Ферментация молока 75,0% 91,7%

Лецитиназная активность 12,5% 50,0%

Липазная активность 75,0% 91,7%

Гемолитическая активность 35,7% (а типа) 58,3% (в типа)

Капсула 37,5% 33,3%

отмечался у 22,8±3,4% больных, дизурические симптомы — у 4,7±1,7%, астенический синдром — у 12,8±2,7% пациентов. Только у четырех пациентов выявлено сочетание выраженных клинических симптомов ИМС (фебрильной гипертермии, симптомов интоксикации, болевого синдрома), воспалительных изменений в клиническом анализе крови и анализах мочи с высокой адгезивной (СПА > 4,41) и ферментативной активностью, наличием капсулы у культур Е./авеаНз, выделенных из мочи этих детей. Эти культуры были выделены из мочи в диагностическом титре 105 КОЕ/мл и выше. Другой связи клинико-лабораторных проявлений ИМС с определенными факторами патогенности фекального энтерококка выявлено не было. У новорожденных и детей до 1 года в 15,4±2,9% случаев отмечались симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта в виде срыгиваний и разжиженного стула.

ОБСУЖДЕНИЕ

Энтерококки, входящие в состав нормальной микрофлоры человека, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых облочек, они описаны как грамположительные факультативные кокки и анаэробы, не образующие спор и капсул. В то же время, энтерококки, являясь представителями группы условно-патогенных бактерий, способны вызывать аутоинфекцию, а при накоплении в окружающей среде приводить к экзогенному инфицированию. Некоторые штаммы Е. /авеаНз проявляют Р-гемолитические свойства [7]. В связи с этим в последние годы возрос интерес к изучению энтерококков как участников инфекционных заболеваний..

Наши исследования показали, что Е. /авеаНз является достаточно распространенным патогеном, вызывая ИМС у детей, наиболее часто у новорожденных (до 75% случаев), воспалительные заболевания органов малого таза и лактационные маститы у женщин.

Известно, что уропатогенная микрофлора колонизирует толстую кишку, перианальную область и у женщин преддверие влагалища и периуретральную область. Взаимодействие Е. /авеаШ и организма хозяина ведет к ИМС [8]. С одной стороны, у микроорганизмов есть особые патогенные свойства, объясняющие возникновение инфекции в неизмененных мочевыводящих путях, с другой — непатогенные штаммы могут вызвать острую инфекцию у пациентов с нарушенной уродинамикой почек, а также при снижении резистентности организма хозяина: у детей и пожилых людей, беременных и больных диабетом, иммунодефицитными состоя-

ниями, в том числе и после пересадки почки [9]. Так, в нашем исследовании выделение Е. ГаесаШ из 1300 образцов мочи у 13 пациентов реанимационного отделения (1,0%), у 12 — онкогематологическо-го центра (0,9%), у 18 с нефротическим синдромом нефрологического отделения, получающих имму-носупрессивную терапию (1,4%), и у 4 пациентов с хронической почечной недостаточностью (0,3%) подтверждает значение этого уропатогена как нозокомиального микроорганизма, поражающего больных с иммунодефицитными состояниями. У всех этих больных на момент исследования не было клинико-лабораторных проявлений инфекции мочевой системы.

Интенсивные исследования последних лет позволили установить, что энтерококки синтезируют большое количество факторов вирулентности, способствующих развитию инфекционного процесса (гемолизин, желатиназа, энтерококковый поверхностный белок, субстанция агрегации, сериновая протеаза, капсула и др.) [7,10]. Наибольшее количество факторов вирулентности выявлено у Е./авеаНз, выделенных из мочи [11]. Высокая протеолитическая активность изучаемого микроорганизма (гидролиз желатины, казеина, коллагена) вызывает токсическое повреждение тканей и способствует тем самым формированию рубцовых изменений в почках при ИМС [7, 9, 12]. Адгезивная активность, как фактор патогенности, является пусковым механизмом инфекционного процесса и создает условия для последующей инвазии в ткани хозяина.

Наши исследования подтвердили высокие вирулентные свойства фекального энтерококка. Наличие у пяти новорожденных сопутствующего инфекционного заболевания в виде внутриутробной и неонатальной пневмонии клинически подтверждает выявленную лабораторно высокую адгезивную способность Е./авеаНз в сочетании с про-теолитической, гемолитической, липолитической и лецитиназной активностью, наличием капсулы, как факторов вирулентности, способствующих развитию и распространению инфекционного процесса.

О выраженных вирулентных свойствах фекального энтерококка мы говорили в наших прежних исследованиях [4] на основании выявленной высокой и множественной антибиотикорезисте-ности штаммов Е. /авеаНз, полученных из мочи новорожденных детей с ИМС. В группе бета-лактамных препаратов высокая резистентность энтерококков отмечена к ампициллину (57,1±5,0%), имипенему (62,5±7,6%), из фторхинолонов — к ципрофлоксацину (57,0±4,9%), из тестируемых

аминогликозидов — к гентамицину (56,5±10,5%). По сравнению с другими антибактериальными препаратами резистентность к нитрофурантоину составляла 38,4±4,95.

Специфических клинических симптомов, характерных для ИМС, вызванной фекальным энтерококком, не обнаружено, однако, ведущим в клинической картине оказался интоксикационный синдром, хотя это можно связать с ранним возрастом пациентов. Вторым по частоте был гипертермический синдром. Не выявлено также четкой зависимости проявления клинических симптомов заболевания от определенного вирулентного фактора. Выявлено, что только совокупность факторов патогенности с высоким уровнем адгезии и высоким титром в моче E. faecalis могут влиять на активность воспалительного процесса в мочевых путях. Но данный факт (в связи с небольшим количеством наблюдений) требует дальнейшего изучения свойств мочевых изолятов E. faecalis.

Таким образом, отличительными критериями, характерными для ИМС энтерококковой этиологии, являются ранний возраст пациентов, фоновые иммунодефицитные состояния, высокая антибио-тикорезистентность. Эти же критерии подтверждают свойства E.faecalis как нозокомиального микроорганизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

E. faecalis выявляется достаточно часто как этиологический фактор ИМС у детей, являясь первостепенным уропатогеном у новорожденных детей. Клинические симптомы ИМС, ассоциированной с E. faecalis, не отличаются от симптомов ИМС другой этиологии, не зависят от определенного фактора патогенности, а только от совокупности факторов в сочетании с высоким уровнем адгезии и высоким титром в моче. Большинство E.faecalis, выделенных от пациентов с урогенитальной патологией, обладают высокими адгезивными свойствами, что создает этим бактериям преимущества в колонизации и инициации инфекционного процесса. Отмеченная вариабельность ферментативной активности факторов, связанных с патоген-ностью, выявила фенотипическую неоднородность энтерококков, что возможно имеет определенную диагностическую значимость. Усиление роли энтерококка, как нозокомиального патогена с высокими вирулентными свойствами, в значительной степени обуславливается многими факторами, в том числе множественной резистентностью к антибиотикам и увеличением числа лиц с иммунодефицитными состояниями. Отсутствие прямой зависимости

клинических симптомов от определенного фактора патогенности требует дальнейшего изучения E. faecalis, как этиологического фактора ИМС у детей, в том числе и на генетическом уровне.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Лопаткин НА, Аполихин ДЮ, Пушкарь АА (ред.) и др. Антимикробная терапия и профилактика инфекций почек, мочевыводящих путей и мужских половых органов: Российские национальные рекомендации. М., 2013; 3-64 [Lopatkin NA, Apolichin DJu, Pushkar’ AA (red.) i dr. Antimikrobnaja terapija i profilaktika infekcij pochek, mochevivodjashih putej i muzhskih polovih organov: Rossijskie nacional’nie rekomedacii. Mosqva, 2013; 3-64]

2. Чащина ИЛ, Таточенко ВК, Баркадзе МД. Место це-фалоспоринов в терапии инфекций мочевыводящих путей у детей. Вопросы современной педиатрии 2012; 11 (1): 158-161 [Chashina IL, Tatochenko VK, Barkadze MD. Mesto cefalosporinov v terapii infekcij mochevivodjashih putej u detej. Voprosi sovremen-noy pediatrii 2012; 11 (1): 158-161]

3. Jawad Kadhum T, AL-Khafaji Sameer F, Samaan Mohammed S. AL-Saeed Virulence Factors of Enterococcus faecalis. Medical Journal of Babylon 2010; 7(4-3): 579-583

4. Мельникова ЕА, Лучанинова ВН, Зайцева ЕА, Андреева ТС. Структура и антибиотикорезистентность уропатогенов, выделенных у новорожденных детей с инфекцией мочевых путей. Практмед 2015; 2 (87): 97-101 [Meljnikova EA, Luchaninova VN, Zajceva EA, Andreeva TS. Struktura i antibiotikorezistentnostj uropa-togenov, videlennih u novorozhdennih detej s infekciej mochevih putej. Prakticheskaja medicina 2015; 2(87): 97-101]

5. Сидоренко СВ. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом. Клин микробиол и антимикробная химиотерапия 2001; 3(4): 301-315 [Sidorenko SV. Infekcionnij process kak «dialog» mezhdu hozjainom i parazitom. Klinicheskaja mikrobiologia i antimikrobnaja himioterapia 2001; 3(4): 301-315]

6. Брилис ВИ, Брилене ТА, Ленцнер ХП и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лаб дело 1986; (4): 210-212 [Brilis VI, Brilene TA, Lencner HP i dr. Metodika izucheniya adgezivnogo processa mikroorganizmov. Laboratornoe delo 1986; (4): 210-212]

7. Бондаренко ВМ, Суворов АИ. Симбиотические энтерококки и проблема энтерококковой оппортунистической инфекции. M., 2007; 2-3 [Bondarenko VM, Suvorov AI. Simbioticheskie enterokokki i problema enterokokkovoy opportunisticheskoy infektsii. M., 2007; 2-3]

8. Moellering MC. Emergence of Enterococcus as a significant pathogen. Clin Infect Dis 1992; (14): 1173-1176

9. Шишкин АН. Инфекция мочевых путей. Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости 2010; (3): 39-45 [Shishkin AN. Infekcia mochevih putey. Novie Sankt-Peterburgskie vracheb-nie vedomosti 2010; (3): 39-45]

10. Elsner HA, Sobottka I, Mack D et al. Virulence factors of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium blood culture isolates. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2000; (19): 39 — 42

11. Cosetino S, Podda G, Corda A et al. Molecular detection of virulence factors and antibiotic resistance pattern in clinical Enterococcus faecalis strains in Sardinia. J prev med hyg 2010; (51): 31-36

12. Мироненко ЛГ, Перетятько ЕГ. Изучение желатиназ-ной активности на генетическом и фенотипическом уровне у ENTEROCOCCUS, выделенных из разных экотопов. Вюник проблем бюлогй i медицини 2013; 1 (4): 239-242 [Mironenko LG, Peretjatjko EG. Izuchenie zhelatinaznoj aktivnosti na genetiches-kom i fenotipicheskom urovne u ENTEROCOCCUS, videlennih iz raznih ekotopov. Visnik problem biology i medicine 2013; 1 (4): 239-242]

Сведения об авторах:

Мельникова Елена Александровна

Россия, 690078, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 27. Краевая детская клиническая больница №1, краевой детский уронеф-рологический центр. Тел.: 8(423)295-68-96, E-mail: melnikova. [email protected] Elena Melnikova, MD

Affiliations: Russia 690078, Vladivostok, ave. Ostryakova, 27. Regional Children’s Hospital №1, regional children’s uronefrology center Phone: 8(423) 2956896 E-mail: [email protected]

проф. Зайцева Елена Александровна

690002, Россия, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 2. Тихоокеанский государственный медицинский университет Минздрава России, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии. Тел.: 8-902-524-57-20, E-mail: [email protected]. Prof. Elena A. Zaytseva, DMedSci.

Affiliations: Russia 690002, Vladivostok, ave. Ostryakova, д.2. Pacific State Medical University MH Russia Department of Mycrobiology, virusology and immunology, Phone: 89025245720

проф. Лучанинова Валентина Николаевна 690002, Россия, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 2. Тихоокеанский государственный медицинский университет Минздрава России; 690078, Россия, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 27. Краевая детская клиническая больница №1, краевой детский уронефрологический центр. Тел.: 8-908-994-18-32, E-mail: [email protected]

Prof. Valentina N. Luchaninova, MD, DMedSci. Affiliations: Russia 690078, Vladivostok, ave. Ostryakova, 27. Regional Children’s Hospital №1, regional children’s uronefrology center Russia 690002, Vladivostok, ave. Ostijakova, д.2. Pacific State Medical University MH Russia Phone: 89089941832

Андреева Татьяна Сергеевна

690002, Россия, г.Владивосток, пр. Острякова, д. 2. Тихоокеанский государственный медицинский университет Минздрава России, студентка V курса, специальность «лечебное дело». Тел.: 8-914-661-98-01, E-mail: atstl@mail. ru Tatуana Andreeva

Affiliations: Russia 690002, Vladivostok, ave. Ostryakova, 2. Pacific State Medical University MH Russia, student Phone: 89146619801; E-mail: [email protected]

Вайсеро Наталья Сергеевна

Россия, 690078, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 27. Краевая детская клиническая больница №1, врач клинико-диагностической лаборатории. Тел.: 8(423) 245-53-81, E-mail: [email protected] Natalja Vajsero MD

Affiliations: Russia 690078, Vladivostok, ave. Ostryakova, 27. Regional Children’s Hospital №1, doctor of clinico-diagnostical laboratory Phone: 8(423) 2455381

Семешина Ольга Владимировна

Россия, 690078, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 27. Краевая детская клиническая больница №1, нефрологическое отделение, кандидат медицинских наук. Тел.: 8(423)245-54-43, E-mail: [email protected] Olga Semeshina MD, PhD

Affiliations: Russia 690078, Vladivostok, ave. Ostryakova, 27. Regional Children’s Hospital №1, department of nephrology Phone: 8(423)2455443

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Поступила в редакцию: 04.01.2016 г. Принята в печать: 18.03.2016 г.

Enterococcus faecalis в моче: лечение, симптомы

При воспалительных заболеваниях мочеполовой системы у женщин при надежде, ослабленных людей, а иногда у ребенка, обнаруживают Enterobacter cloacae в моче. В норме эта бактерия неопасна, и долгое время может жить в организме, не вызывая проблем. Если же количество ее значительно возрастает, то больному необходимо лечение. Суть терапии заключается в применении антибактериальных препаратов тех групп, к которым чувствительна бактерия Enterobacter aerogenes, faecalis или faecium.

Превышение уровня энтерококка в моче – симптом развития воспалительного процесса в в мочеполовой системе.

Что это за бактерия?

Энтерококк является частью условно-патогенной микрофлоры и в норме полностью безвредный.

Энтерококк — микроскопический одноклеточный организм. Enterococcus бывает нескольких видов: faecalis, faecium, aerogenes и другие. Именно Enterococcus faecalis (фекальный энтерококк) способен вызывать развитие тяжелых болезней в организме человека или проживать в нем, не принося никакого вреда. Некоторые из них участвуют в процессе пищеварения, и являются незаменимыми в расщеплении углеводов. Но если концентрация их в моче превышена (норма составляет 10 3 степени при бактериоскопическом исследовании), то это является поводом избавиться от этих микроорганизмов. Такое огромное количество может привести к болезни.

Вернуться к оглавлению

Причины и симптомы

Нанесет ли энтеробактер вред человеку, зависит от количества бактерий и состояния иммунной защиты организма. Причинами развития патологий при обнаружении энтерококков в мочевыводящей системе являются:

Энтерококк в организме красит урину, учащает диурез, вызывает зуд в уретре.

• застой мочи при беременности и формирование благоприятной среды для чрезмерного размножения бактерий;
• недостаточное соблюдение правил интимной гигиены;
• частая смена половых партнеров;
• бесконтрольный прием препаратов, подавляющих местный иммунитет, в огромных количествах;
• недостаточная обработка ранений и ушибов.

Если повышается количество sp (одного вида энтеробактерии) в моче, то она становится мутной. Возникают неприятные ощущения в уретре. Появляются частые позывы к мочеиспусканию и значительно повышается температура тела. Половые органы больного опухают и приобретают ярко-розовую окраску. У женщин появляются боли во время полового акта.

Вернуться к оглавлению

Особенности при беременности

Если у женщины в положении моча содержит большое количество sp энтеробактерий, а именно рода фекалис, то это свидетельствует о возможном развитии воспалительного процесса в почках и других органах мочевыделительной системы. Однако выделение бактерий при посеве мочи не всегда вызывает какие-либо симптомы. Такое случается ведь организм беременной женщины не может в достаточной мере противостоять размножению этих бактерий. Лечение бессимптомной бактериурии у беременных обязательно. Превышением нормы считается отклонение от 100 тыс. ед. выше на 1 см³ биожидкости. Зачастую такой результат говорит о развитии цистита или уретрита.

Наличие энтерококка на кожи материнской груди вызывает заражение у грудничка при первом принятии пищи.

Вернуться к оглавлению

Анализы, выявляющие в моче Enterococcus faecalis

Энтеробактер можно обнаружить при посеве биологического материала на питательную среду. Этот метод называется бактериологическим. После некоторого времени в лабораторных условиях формируются колонии, от их количества зависит патогенен или нет для организма Enterococcus faecalis или другой вид. Кроме этого, используют серологическое исследование на наличие антигенов. Обязательно исследуется кал на общие показатели.

Вернуться к оглавлению

Лечение больного или носителя

В основе терапии, направленной на сдерживание роста патогенной флоры и стабилизации результата, лежит прием специальных бактериофагов для нормализации кишечной среды. Для выведения с организма этой бактерии используют антибиотики, но их выбор зависит от чувствительности конкретных колоний Enterococcus faecalis к различным группам препаратов, а также основан на особенностях самого организма. Кроме этого, больному вместе с антибактериальной терапией от Enterococcus faecium, aerogenes или faecalis для предупреждения развития дисбактериоза, назначают противогрибковые препараты. Лекарства комбинируются — системные совмещаются с местными (свечи, гели, мази). После курса терапии или во время показан прием пробиотиков, витаминных и минеральных комплексов.

Россельхознадзор — Региональные новости

© ФГУ Краснодарская МВЛ Энтерококки широко распространены в окружающей среде и особенно в почве и экскрементах. Этих микроорганизмов выявляют в кишечнике и фекалиях приблизительно 95 % обследованных животных и людей. Последнее обстоятельство делает необходимой и возможной санитарную оценку кормов и продуктов питания, а также степени очистки воды по наличию их контаминации энтерококками. В отделе бактериологии ФГБУ «Краснодарская МВЛ» энтерококки чаще всего выделялись из: смывов с кожи, слизистых оболочек, отделяемого глаз, половых органов, мочи и фекалий собак. Длительное время данные микроорганизмы рассматривали как безвредных комменсалов многих видов животных и человека. Такая оценка их патогенного потенциала оказалась не совсем верной и первыми забили тревогу медики, так как энтерококки, кроме пищеварительного тракта, стали выделяться из влагалища, ротовой полости, желче- и мочевыводящих путей, а также верхнего отдела респираторного тракта при клинических признаках инфекции. Абсолютным лидером в своём расспространении в организме и частоте зарегестрированных клинических случаев инфекции среди населения стал Enterococcus faecalis. Случаев аналогичных клинических проявлений энтерококковых инфекций у собак не зарегестрировано, но, как показывает история, это может быть иллюзией, возникающей на фоне недостатка исследований, проводимых в данном направлении. Энтерококкоз собак вызывают следующие представители рода: Enterococcus faecalis, Enterococcus avium, Enterococcus hirae. В настоящее время род Enterococcus входит в состав семейства Enterococcacea, а последнее в порядок Lactobacillales. Энтерококки весьма устойчивы во внешней среде, прогревание при 60°С инактивирует их в течение 30 минут. Высокая концентрация хлористого натрия и желчи не оказывает отрицательного влияния на рост многих штаммов этих микроорганизмов. Хлорирование является хорошим способом дезинфекции объектов, контаминированных энтерококками. Рост резистентности к антибиотикам не обошёл стороной и энтерококки. У многих штаммов отмечено снижение чувствительности к пенициллину, цефалоспориновым антибиотикам, аминогликозидам, левомицетину, гентамицину, стрептомицину, тетрациклинам, линкозамидам и сульфаниламидным препаратам. Симптоматика. В подавляющем случае инфекция энтерококков протекает у собак бессимптомно, но в некоторой доступной нам литературе обнаружены несколько сообщений о клинических формах энтерококкозов у собак. Первая из этих публикаций касается бактериологического исследования мочи собак, страдавших заболеваниями мочевыделительной системы, в ряде этих случаев была диагностирована инфекция Enterococcus faecalis. Второе сообщение касается дискоспондилита собаки, вызванного тем же энтерококком. Что касается животных, хозяева которых обратились в нашу лабораторию с целью исследования клинического материала от собак, то клинические проявления были следующие: конъюнктивиты, циститы, мочекаменная болезнь, дисбактериозы, характеризующиеся избытком и недостатком энтерококков, стоматиты, в редких случаях дерматиты, в которых энтерококк выступал сопутствующей стафилококку и другим бактериям микрофлорой, вагиниты, поститы, отиты. Диагностика проводилась бактериологическим методом, включающим в себя первичную микроскопию исследуемого материала, выделение и идентификацию чистой культуры по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам, при необходимости проводилось биологическое исследование путём постановки биопробы, также использовались импортные тест-системы и баканализатор. Проводилась подтитровка выделенных культур к антибактериальным препаратам: пенициллинам, тетрациклинам, цефалоспоринам, макролидам, нитрофуранам и др., а также к стрептококковому бактериофагу. P.S. Всё вышеизложенное поможет владельцам животных точнее понять этиологическую роль энтерококков в развитии патологических процессов у собак и внимательнее относиться к своим питомцам, чтобы те, в свою очередь, не стали причиной заболеваний людей.

Необычная причина мочевых симптомов | Pfizer для Профессионалов

* By submitting the completed data in the registration form, I confirm that I am a healthcare worker of the Russian Federation and give specific, informed and conscious consent to the processing of personal data to the Personal Data Operator Pfizer Innovations LLC (hereinafter referred to as the “Operator”) registered at the address: St. Moscow, Presnenskaya embankment, house 10, 22nd floor.

I grant the Operator the right to carry out the following actions with my personal data, as well as information about my hobbies and interests (including by analyzing my profiles on social networks): collecting, recording, systematizing, accumulating, storing, updating (updating, changing) , extraction, use, transfer (access, provision), deletion and destruction, by automated and (or) partially automated (mixed) processing of personal data.

Consent is granted with the right to transfer personal data to affiliated persons of Pfizer Innovations LLC, including Pfizer LLC (Moscow, Presnenskaya naberezhnaya, 10, 22nd floor), and with the right to order the processing of personal data, incl. h. LLC «Redox» (Moscow, Volgogradskiy prospect, house 42, building 42A, floor 3, room 3) and LLC «Supernova» (Moscow, Varshavskoe shosse, house 132), which processes and stores personal data.

The processing of my personal data is carried out for the purpose of registering on the Operator’s website www.pfizerprofi.ru to provide me with access to information resources of the Pfizer company, as well as to interact with me by providing information through any communication channels, including mail, SMS, e-mail, telephone and other communication channels.

This consent is valid for 10 (ten) years.

I have been informed about the right to receive information regarding the processing of my personal data, in accordance with the Federal Law of July 27, 2006 No. 152-FZ «On Personal Data».

This consent can be revoked by me at any time by contacting the address of the Operator-Pfizer Innovations LLC or by phone. 8 495 287 5000.

*Отправляя заполненные данные в регистрационной форме, я подтверждаю, что являюсь работником здравоохранения Российской Федерации и даю конкретное, информированное и сознательное согласие на обработку персональных данных Оператору персональных данных ООО «Пфайзер Инновации» (далее «Оператор»), зарегистрированному по адресу: г. Москва, Пресненская набережная, дом 10, 22 этаж.

Я предоставляю Оператору право осуществлять с моими персональными данными, а также сведениями о моих хобби и увлечениях (в том числе с помощью анализа моих профилей в социальных сетях) следующие действия: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), удаление и уничтожение, путем автоматизированной и (или) частично автоматизированной (смешанной) обработки персональных данных.

Согласие предоставляется с правом передачи персональных данных аффилированным лицам ООО «Пфайзер Инновации», в т. ч. ООО «Пфайзер» (г. Москва, Пресненская набережная, дом 10, 22 этаж), и с правом поручения обработки персональных данных, в т.ч. ООО «Редокс», (г. Москва, Волгоградский проспект, дом 42, корпус 42А, этаж 3, ком. 3) и ООО «Супернова» (г. Москва, Варшавское шоссе, дом 132), осуществляющим обработку и хранение персональных данных.

Обработка моих персональных данных осуществляется с целью регистрации на сайте Оператора www.pfizerprofi.ru для предоставления мне доступа к информационным ресурсам компании Пфайзер, а также для взаимодействия со мной путем предоставления информации через любые каналы коммуникации, включая почту, SMS, электронную почту, телефон и иные каналы коммуникации.

Срок действия данного согласия — 10 (десять)лет.

Я проинформирован (-а) о праве на получение информации, касающейся обработки моих персональных данных, в соответствии с Федеральным законом от 27. 07.2006 г. №152-ФЗ «О персональных данных».

Данное согласие может быть отозвано мною в любой момент посредством обращения по адресу нахождения Оператора-ООО «Пфайзер Инновации» или по тел. 8 495 287 5000.

Enterococcus faecalis в моче у женщин: причины, как выявляют, лечение

Enterococcus faecalis – вид энтерококков, входящих в состав нормальной микрофлоры некоторых отделов пищеварительного тракта человека, некоторых других млекопитающих, а также птиц.

Характерно, что кроме тонкой и толстой кишки, может обнаруживаться в ротовой полости, в половых органах, также у мужчин в губчатой части мочеиспускательного канала. Являясь симбионтом, частью нормальной микрофлоры, заселяет кишечник с первых дней жизни, причем более активно при грудном вскармливании. Энтерококки присутствуют в кале взрослого человека, но появление Enterococcus faecalis в моче не норма, и говорит о патологическом процессе. Называют это явление бактериурией.

Бактериурия бывает в том числе и бессимптомной, особенно во время беременности, но стертая клиника не повод отказываться от лечения. В противном случае инфекция может распространиться, осложниться, хронизироваться.

Что представляют собой фекальные энтерококки

Энтерококками называют молочнокислые грам+ бактерии, являющиеся факультативными анаэробами. Это означает, что они поддерживают жизнедеятельность как в присутствии кислорода, так и при его дефиците.

Для человеческого организма в норме они являются симбионтами, и их задача – поддерживать кислотность среды на уровне 4,3–4,5 pH. За счет чего это достигается? Для энтерококков характер метаболизм бродильного типа. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы ферментируют углеводы. Один из продуктов метаболизма – молочная кислота, обеспечивающая устойчивость слизистой к колонизации патогенами. Энтерококки поддерживают нормальную жизнедеятельность при температуре от 36 до 37°C.

И хотя эти микроорганизмы являются неотъемлемой частью человеческого микробиома, их излишне активное, бесконтрольное размножение, а также попадание в те структуры, где в норме их быть не должно, в итоге приводит к инфекционным болезням.

Появление фекального энтерококка в моче говорит об инфекции мочевыводящих путей. Попадая в другие области, в норме стерильные, вызывает интраабдоминальные инфкеции, эндокардиты и проч. Эти же микроорганизмы нередко становятся причиной внутрибольничных инфекций, запросто колонизируют предметы обихода, весьма устойчивы к воздействию дезинфицирующих средств.

Фекальный энтерококк и воспаления мочевыводящих путей

Если говорить о бактериурии, то есть наличии бактерий в моче, то примерно в 10–15% случаев возбудителем является Ent. faecalis, в зависимости от заболевания. Характерно, что иные представители рода Энтерококк не встречаются среди возбудителей воспалений мочевыводящих путей.

Появление бактерий в моче говорит о воспалительном процессе в мочевыводящих путях, почках, мочевом пузыре. Попадают патогены восходящим путем (чаще у женщин, ведь уретра короткая и широкая), нисходящим, лимфогенным или гематогенным.

У женщин бактериурию диагностируют чаще, чем у мужчин, что связано с анатомическими особенностями мочевыделительной системы.

Появление Enterococcus faecalis в моче может говорить о наличии следующих заболеваний:

• цистит;
• пиелонефрит;
• уретрит;
• интерстициальный нефрит и проч.

При этом жалуются на частое мочеиспускание, боли и рези во время мочеиспускания, неприятный запах мочи, боли внизу живота, нарастание температуры тела и другие симптомы.

Бессимптомная бактериурия встречается примерно у 7% беременных, она увеличивает риск развития пиелонефрита на поздних сроках беременности в среднем в 30% случаев.

Если клинические проявления отсутствуют, инфекцию диагностируют при обнаружении не менее 10 в 5 КОЕ/мл собранной мочи (без катетеризации мочевого пузыря) в двух последовательно собранных порциях. Интервал составляет не менее суток, но не более 7 суток. Если клинические проявления есть либо же забор биоматериала осуществляется при помощи катетера, то диагностический порог уменьшается до 10 в 3 или 10 в 2 микробных тел в 1 мл мочи. В случае с беременными при концентрации менее чем 10 в 5 КОЕ/мл все равно назначается лечение, чтобы снизить вероятность развития акушерских, неонатальных (то есть последствий для новорожденного ребенка) и урологических осложнений.

Факт:
При отсутствии симптомов нередко говорят об асимптоматической бактериурии, и нести она может скрытую угрозу. Вместе с тем может сочетаться с проявлениями воспаления мочевого пузыря, почек, предстательной железы, уретры.

Как диагностировать

Выявляют патогенные микроорганизмы в моче при помощи метода полимеразной цепной реакции – ПЦР. Суть метода – исследование специфических фрагментов ДНК микроорганизма в тестируемом образце мочи. Для анализа также используют другие биоматериалы.

Результат оценивают в колониеобразующих единицах на 1 мл биоматериала.

Клинико-микробиологические аспекты инфекции мочевой системы, ассоциированной с Enterococcus faecalis | Зайцева

1. Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков. Екатеринбург: Уральское отделение Российской академии наук. Ин-т клеточного и внутриклеточного симбиоза, 2012. 222 с.

2. Вялкова А.А., Гриценко В.А. Инфекция мочевой системы у детей: современные аспекты этиологической диагностики и лечения // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2017. Т. 62, № 1. С. 99—108. doi: 10.21508/1027-4065-201762-1-99-108

3. Загрубина А.Н., Калмыкова А.С., Муравьева В.Н. Мониторинг чувствительности возбудителей инфекции мочевой системы у детей первых пяти лет жизни г. Ставрополя // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2012. Т. 25, № 1. С. 29—32.

4. Зайцева Е.А., Куркович Е.В., Мельникова Е.А., Лучанинова В.Н., Коменкова Т.С., Вайсеро Н.С. Роль факторов патогенности Enterococcus faecalis в развитии пиелонефрита у детей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2017. № 2 (68). С. 58—61. doi: 10.17238/PmJ1609-1175.2017.2.58-61

5. Леженко Г.А., Пашкова Е.Е., Петрашина Е.Н., Рудова Е.И. Исследование бактериального спектра возбудителей инфекции мочевыделительной системы как залог рациональной антибактериальной терапии у детей // Здоровье ребенка. 2016. № 7 (75). С. 35—40. doi: 10.22141/2224-0551.7.75.2016.86721

6. Лойман Э., Цыгин А.Н., Саркисян А.А. Детская нефрология: практическое руководство. М.: Литтерра, 2010. 400 с.

7. Мельникова Е.А., Зайцева Е.А., Лучанинова В.Н., Крукович Е.В., Горелик Н.В., Семешина О.В., Коменкова Т.С. Применение модифицированного способа определения лейкоцитарного индекса эндогенной интоксикации у детей с инфекцией мочевой системы // Врач. 2017. № 11. С. 83—84.

8. Мельникова Е.А., Лучанинова В.Н., Зайцева Е.А., Семешина О.В. Структура и антибиотикорезистентность уропатогенов, выделенных у новорожденных с инфекцией мочевых путей // Практическая медицина. 2015. Т. 2, № 2 (87). С. 97—100.

9. Скепьян Е.Н., Василевский И.В., Топтун П.Д. Анализ спектра возбудителей инфекции мочевыводящих путей и характеристика их чувствительности к противомикробным лекарственным средствам у детей на амбулаторном этапе // Медицинская панорама. 2013. № 8. С. 35—38.

10. Чащина И.Л., Таточенко В.К., Баркадзе М.Д. Место цефалоспоринов в терапии инфекций мочевыводящих путей у детей // Вопросы современной педиатрии. 2012. Т. 11, № 1. С. 158—161.

11. Чугунова О.Л., Шумихина М.В., Думова С.В. Современные представления об инфекции мочевой системы у новорожденных и детей раннего возраста // Эффективная фармакотерапия. 2013. № 42. С. 38—47.

12. Horsley H., Malone-Lee J., Holland D., Tuz M., Hibbert A., Kelsey M., Kupelian A., Rohn J.L. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urotelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One, 2013, vol. 8, no. 12: e83637. doi: 10.1371/journal.pone.0083637

13. Kaufman J., Templ-Smith M., Sanci L. Urinary tract infection in children: an overview of diagnosis and management. BMJ Paediatrics Open, 2019, no. 3: e000487. doi: 10.1136/bmjpo-2019-000487

14. Lai H.C., Chang S.N., Lin H.C., Hsu Y.L., Wei H.M., Kuo C.C., Hwang K.P., Chiang H.Y. Association between urine pH and common uropathogens in children with urinary tract infections. J. Microbiol. Immunol. Infect., 2019, 9 p. doi: 10.1016/j.jmii.2019.08.002

15. Walawender L., Hains D.S., Schwaderer A.L. Diagnosis and imaging of neonatal UTIs. Pediatr. Neonatol., 2020, vol. 61. no. 2, pp. 195-200. doi: 10.1016/j.pedneo.2019.10.003

Инфекция в развитии патологий мочевой системы у собак и кошек

Важность бактериологического исследования определяется, в том числе той тенденцией, что с каждым годом патологии ранее относящиеся к заболеваниям неинфекционной этиологии теперь признаются инфекционными.

Например, в этиологии атеросклероза доказана роль для Chlamydia pneumonia. Та же бактерия участвует в развитии и прогрес-сировании кардиоваскулярнои патологии. (Lee Ann Cambell et al., 1998). M. Miller-Hijelle и соавт. (1997) утверждают, что поликистоз почек (PKD) можно рассматривать, как новую инфекционную болезнь и/или микробный токсикоз чувствительных популяций людей. Серологические тесты выявили наличие в кистозной жидкости антигенов Fusarium, Aspergillus и Candida.

Инфекции мочевой системы разделяются, с позиции антибактериальной терапии, на инфекции верхних отделов мочевыводящей системы (пиелонефрит) и нижних отделов мочевыводящей системы(цистит, уретрит). В отдельную группу стоит выделить пациентов с бессимптомной бактериуриеи, при которой выявляется контаминация мочи микрофлорой в диагностическом титре КОЕ 10s, а так же животных с клиническим проявлением вагинита и постита. Данные состояния требуют соответствующей терапии, контроля со стороны мочевой системы и диспансеризации пациентов.

В настоящее время в медицине установлено, что при наличии предрасполагающих факторов, понижающих резистентность организма, развитие патологий мочевой системы обусловлено уропатогенами сем. Enterobacteriaceae, Enterococcus spp. Staphylococcus spp., цитопатогенами сем, Mycoplasmatacea.

За период 2007 года нами было происследовано 115 собак и 74 кошки с патологией мочевой системы различной локализации. По данной группе проводился комплекс мероприятий включающий лабораторные и дополнительные.методы исследований подтверждающие соответствующую патологию. Обязательным пунктом для такого рода пациентов является проведение бактериологического исследования мочи с определением чистой культуры возбудителя и подтитровкой антибактериальных средств, так как данного рода патологии носят инфекционно- воспалительный характер.

В результате мы получили следующие результаты.
Из числа исследованной мочи собак выявлено 54 пробы с наличием патогенной микрофлоры, что составило 47 %.

Из них:
E.coli 18 проб, что составляет 33,3 % от общего количества инфицированных проб мочи собак
Enterococcus faecalis 14 проб, что составляет 25,9 %
Proteus spp. 4 пробы, что составляет 7,4 %
Staphylococcus, auerus 2 пробы, что составляет 3,7 %
Ureaplazma 7 проб, что составляет 12,9 %
Micoplasma 9 проб, что составляет 16,6 %

Из числа исследованной мочи кошек выявлено 58 проб с наличием патогенной микрофлоры, что составило 78,4 %.

Из них:
Е. coli 6 проб, что составило 10,3 % от общего количества инфицированных проб мочи кошки
Enterococcus faecalis 11 проб, что составило 18,9%
Proteus spp. 11 пробы, что составило 18,9 %
Staphylococcus auerus 8 проб, что составило 13,7 %
Ureaplazma 10 проб, что составило 17,2 %
Micoplasma 11 проб, что составило 18,9 %
Enterobacter 1 проба, что составило 1,7 %
Следует отметить, что встречались микробные ассоциации(миксты).
Такие как Ureaplazma urealitica + Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis + Proteus spp, Ureaplazma urealitica + Staphylococcus auerus.

Положительные результаты бактериологического анализа мочи при урологических патологиях удается получить не всегда. Ответ на это дает определение «окна инфекции».

Лечение бактериальных инфекций мочевой системы, с одной стороны, проще по сравнению с инфекциями других локализаций, так как в этом случае возможна точная этиологическая диагностика. С другой стороны, при осложненных инфекциях мочевыводящих путей всегда имеется фактор (обструкция или другая), поддерживающая инфекционный процесс, и в этом случае достигнуть полного клинического или бактериологического излечения сложно.

Проводимое нами динамическое исследование патологий мочевой системы на сегодняшний день говорит об изменении микробной контаминации мочи в сторону грамположительной микрофлоры, росте цитопатогенов и участие последних в микст инфекциях. Хотя аналогичные исследования в гуманитарной медицине свидетельствуют о преимущественно 75-85%, причастности грамотрицательной микрофлоры сем. Enterobacteriaceae. Исходя из этого, назначение антибактериальной терапии должно складываться не из «норм» и «золотых стандартов», а желательно с позиции этиотропности развития патологического процесса. Это качественно повысит терапевтическую эффективность лечения, а так же поиск более рациональных средств терапии.

Исаченко СМ., Ломоносов П.Л. Ветеринарная клиника «Доктор Вет» г. Минск
Юхнович Л.Н. Минская городская ветеринарная лаборатория

Enterococcus faecalis: инфекции, передача и лечение

Enterococcus — это тип бактерий, которые обычно присутствуют в кишечнике и кишечнике.

В некоторых случаях эту бактерию можно также найти во рту или во влагалище.

У здоровых людей или в нормальных количествах Enterococcus обычно не вызывает проблем.

Но если он распространяется на другие части тела, он может вызвать опасные для жизни инфекции. Люди, находящиеся в больнице или имеющие сопутствующие заболевания, подвергаются более высокому риску развития инфекции.

Хотя существует 17 или более видов Enterococcus , у человека обычно встречаются только два: E. faecalis и E. faecium .

Эта статья посвящена E. faecalis , ассоциированным с ним инфекциям, способам его передачи и вариантам лечения.

Поделиться на Pinterest Бактерии энтерококка faecalis. Первоначально эта бактерия была связана со стрептококком.
Изображение предоставлено: Дженис Хейни Карр, CDC / Пит Уорделл.

До 1984 года, E.faecalis был известен как Streptococcus faecalis . Ученые ранее относили бактерии к роду Streptococcus .

По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), E. faecalis является причиной примерно 80 процентов случаев заражения людей.

Бактерии могут вызывать инфекцию у людей при попадании в раны, кровь или мочу. Особому риску подвержены люди с ослабленной иммунной системой, например, те, кто:

• имеют слабый иммунитет из-за болезни или операции
• проходят курс лечения рака
• находятся на диализе
• получают трансплантацию органов
• имеют ВИЧ или СПИД
• имели корневой канал

Люди в больницах особенно уязвимы для E.faecalis , поскольку у госпитализированных пациентов обычно снижен иммунитет. Обычное использование внутрисосудистых и мочевых катетеров также может способствовать распространению инфекции, поскольку эти инструменты часто содержат бактерии E. faecalis .

E. faecalis считается одной из трех основных причин внутрибольничных инфекций.

Поделиться на PinterestИнфекция мочевыводящих путей может быть вызвана E. faecalis, а инфекция, вызванная этим типом бактерий, может вызвать болезненные ощущения при мочеиспускании.

E. faecalis вызывает ряд инфекций у людей, некоторые из которых могут быть опасными для жизни.

Бактерии могут вызывать:

• бактериемию, наличие бактерий в крови
• инфекции брюшной полости и таза
• инфекции мочевыводящих путей
• инфекции полости рта, особенно корневые каналы
• сепсис или заражение крови
• раневые инфекции
• эндокардит, инфекция внутренней оболочки сердца
• энтерококковый менингит, необычная форма менингита

Симптомы E.faecalis зависит от локализации инфекции. Они могут включать:

• усталость
• болезненное мочеиспускание
• спазмы желудка
• рвота

E. faecalis обладает как естественным, так и приобретенным иммунитетом от лечения антибиотиками. В результате это один из наиболее устойчивых к антибиотикам типов бактерий.

Бактерии также могут переносить различные условия. Он может выжить в диапазоне температур и в кислой или щелочной среде.

E. faecalis может противостоять лечению многими антибиотиками из-за:

• Образование биопленки : бактерии могут связываться друг с другом, образуя тонкий, но прочный слой, известный как биопленка, который может прочно прилипать к поверхности.
• Потребности в питании : E. faecalis может выдерживать длительные периоды времени без источника питания. Он даже может использовать сыворотку крови в качестве источника питания.
• Пенициллин-связывающие белки (PBP) : Эти белки образуют E.faecalis естественно устойчивый к пенициллину. Пенициллин подавляет активность E. faecalis , но не разрушает бактериальные клетки.
• Поглощение фолиевой кислоты в окружающей среде : Бактериям для роста требуется фолиевая кислота. Большинство из них не могут поглотить его из окружающей среды, поэтому должны сделать это самостоятельно. Лекарства, которые препятствуют выработке фолиевой кислоты, часто могут уничтожить бактериальные инфекции. Однако E. faecalis может абсорбировать фолиевую кислоту из окружающей среды, поэтому эти препараты малоэффективны.

Энтерококки чаще всего передаются из-за плохой гигиены.

Поскольку он естественным образом присутствует в желудочно-кишечном тракте, E. faecalis обнаруживается в фекалиях. Неправильная чистка предметов, содержащих фекалии, или отказ от мытья рук после использования туалета могут увеличить риск передачи бактерий.

Повседневные предметы, такие как телефоны, дверные ручки, полотенца и мыло, также могут содержать E. faecalis .

Бактерии могут распространяться по больницам, если медицинские работники не моют руки между пациентами.Без тщательной очистки катетеры или диализные порты также могут передавать инфекцию.

Соблюдение правил гигиены, особенно в условиях больницы, может помочь предотвратить распространение инфекции E. faecalis .

Профилактические меры включают:

• тщательное мытье рук, включая кончики пальцев и большие пальцы рук, после посещения туалета
• мытье рук перед едой или питьем
• обеспечение того, чтобы медицинские работники мыли руки перед контактом с внутривенными инъекциями, катетерами и повязками.
• обеспечение того, чтобы медицинские работники тщательно мыли руки между пациентами
• избегая использования чужих предметов личной гигиены, таких как мыло, мочалки, полотенца и бритвы
• избегая сидения на кроватях других пациентов
• избегая использования туалетов другие пациенты, а также туалеты, которые выглядят грязными или грязными
• регулярная уборка туалетов и туалетов
• протирка дверных ручек, пультов дистанционного управления, телефонов и других предметов общего пользования
• частое мытье рук пациентами, персоналом и посетителями больницы

Поделиться в Pinterest при неосложненных инфекциях.В зависимости от серьезности инфекции назначаются разные виды антибиотиков.

Из-за своих механизмов лекарственной устойчивости инфекция Enterococcus представляет собой серьезную проблему для лечения медицинских работников.

Перед лечением врачи часто берут образцы бактерий у пациентов. Они определяют восприимчивость образца к различным видам лечения, включая ампициллин, пенициллин и ванкомицин.

Неосложненную инфекцию часто можно лечить одним антибиотиком.Если резистентности к антибиотикам нет, предпочтительным лекарством является ампициллин.

Другие варианты лекарств включают:

• ампициллин с сульбактамом
• даптомицин
• линезолид
• нитрофурантоин
• тигециклин
• ванкомицин

Более тяжелые инфекции могут включать сепсис, эндокардит или менингит. Для лечения этих инфекций может потребоваться комбинация агента, действующего на клеточную стенку, и класса антибиотиков, известных как аминогликозиды.

Агенты, действующие на клеточную стенку, представляют собой антибиотики, которые воздействуют на бактериальную клеточную стенку, подавляя рост клеток. Примеры включают ампициллин, ванкомицин и аминогликозиды, в том числе гентамицин и стрептомицин.

При более серьезной инфекции лечение может длиться несколько недель.

Энтерококковые инфекции обычно возникают у уже больных людей. Это может затруднить определение того, является ли бактериальная инфекция причиной любого последующего заболевания или смерти.

Некоторые исследования показывают, что прогноз для людей с E.faecalis связана с состоянием их здоровья, а не с наличием бактериальных штаммов.

Другие исследования показали, что пациенты с инфекцией, вызванной штаммами устойчивых к ванкомицину Enterococcus , имели более высокий уровень смертности, чем пациенты со штаммами, чувствительными к антибиотику.

Инфекции, вызванные устойчивыми к антибиотикам бактериями, как правило, приводят к более длительному пребыванию в больнице, более высоким расходам на здравоохранение и более высокому уровню смертности по сравнению с инфекциями, вызванными чувствительными к антибиотикам бактериями.

Надлежащая гигиена — лучший способ предотвратить передачу инфекции E. faecalis .

Энтерококковые инфекции — инфекционные болезни

• Зависит от места заражения и тестирования чувствительности

Энтерококки, связанные с эндокардитом, трудно искоренить, если для достижения бактерицидной активности не используется комбинация определенных препаратов, действующих на клеточную стенку (например, пенициллин, ампициллин, амоксициллин, пиперациллин, ванкомицин) плюс аминогликозиды (например, гентамицин, стрептомицин).Однако некоторые препараты, действующие на клеточную стенку, обладают ограниченной активностью против энтерококков или вообще не обладают ими; они включают нафциллин, оксациллин, тикарциллин, эртапенем, большинство цефалоспоринов и азтреонам. E. faecium более устойчивы к пенициллину, чем E. faecalis . Когда аминогликозид нельзя использовать, комбинация аминопенициллина, такого как ампициллин, плюс цефтриаксон является эффективной альтернативой для лечения эндокардита, вызванного E. faecalis . Имипенем и, в меньшей степени, меропенем активны против E.faecalis .

При осложненных кожных инфекциях, вызванных чувствительными к ванкомицину энтерококками, эффективными вариантами лечения являются даптомицин, линезолид, тедизолид, тигециклин и омадациклин.

Пиперациллин / тазобактам, имипенем или меропенем, тигециклин и эравациклин рекомендуются при осложненных внутрибрюшных инфекциях, когда известно или предполагается, что в них вовлечены энтерококки.

Инфекции мочевыводящих путей не требуют бактерицидной терапии и, если возбудитель чувствителен, обычно лечат одним антибиотиком, таким как ампициллин.Нитрофурантоин и фосфомицин часто эффективны против устойчивой к ванкомицину энтерококковой инфекции мочевыводящих путей.

За последние несколько десятилетий резистентность к нескольким противомикробным препаратам быстро возросла, особенно среди E. faecium .

Устойчивость к аминогликозидам (например, гентамицину, стрептомицину), особенно к E. faecium , продолжает проявляться.

Устойчивые к ванкомицину энтерококки (VRE) могут также быть устойчивыми к другим гликопептидам (например, тейкопланину), аминогликозидам и активным бета-лактамам (например, пенициллину G, ампициллину).При выявлении инфицированные пациенты строго изолированы. Рекомендуемое лечение включает стрептограмины (хинупристин / далфопристин только для E. faecium ) и оксазолидиноны (линезолид, тедизолид). Даптомицин, оритаванцин, тигециклин и эравациклин обладают in vitro активностью в отношении VRE и могут быть вариантами лечения не по назначению.

Энтерококки, продуцирующие бета-лактамазу, иногда вызывают проблемы, особенно когда в тканях присутствует большое количество организмов (например, в эндокардитной вегетации).Резистентность может присутствовать клинически, даже если организм кажется чувствительным на основании стандартного тестирования. Можно использовать ванкомицин или комбинацию антибиотиков, ингибирующих бета-лактам / бета-лактамаз (например, пиперациллин / тазобактам, ампициллин / сульбактам).

Энтерококки могут включать экзогенно продуцируемые фолаты и тем самым обращать вспять действие триметоприма и сульфаметоксазола; следовательно, терапия этими препаратами может оказаться безуспешной, несмотря на очевидную чувствительность in vitro (по этой причине TMP / SMX часто не включается в панели чувствительности к энтерококкам).

Enterococcus faecalis Инфекции мочевыводящих путей: имеют ли они зоонозное происхождение?

Резюме

Основные патогенные микроорганизмы человека часто выделяются от мясных животных, особенно от домашней птицы. Среди них Enterococcus faecalis , который, как известно, является одной из основных причин инфекций мочевыводящих путей человека во всем мире. В начале 2015 года мы обнаружили несколько последовательных аномальных увеличений еженедельного числа заражений человека, вызываемых E. faecalis , в различных медицинских учреждениях региона Прованс-Альпы-Лазурный берег Франции, особенно в том числе внебольничные инфекции мочевыводящих путей .Предполагая, что это общерегиональное эпидемиологическое событие могло быть вызвано продуктами питания животного происхождения, мы начали эту работу, чтобы дать обзор эпидемиологии E. faecalis , уделяя особое внимание возможной связи между клонами E. faecalis . изолированы от сельскохозяйственных животных и от лиц, ответственных за инфекции мочевыводящих путей человека. На тот момент только одно исследование четко выявило сильные эпидемиологические связи между клонами E. faecalis , выделенными от сельскохозяйственных животных, и человеческими E.faecalis Инфекции мочевыводящих путей. Это наблюдение в сочетании с нашим эпидемиологическим опытом в масштабах всего региона приводит нас к твердому убеждению, что E. faecalis является настоящим зоонозным патогеном, потенциально оказывающим весьма существенное влияние на здоровье человека. Это вызывает особую озабоченность из-за его способности приобретать гены устойчивости к антибиотикам и инфицировать животных и людей. Для устранения этой угрозы общественному здоровью необходимо срочно реализовать различные стратегии, в частности, путем разработки и внедрения крупных интегрированных автоматизированных систем наблюдения, основанных на данных о здоровье животных и человека, которые позволят нам обнаружить E.faecalis эпидемиологических событий.

Ключевые слова

Инфекция мочевыводящих путей

E. faecalis

Зооноз

Автоматизированная система эпиднадзора

Вспышка

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

© 2016 The British Infection Association. Опубликовано Elsevier Ltd. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Журналы открытого доступа | OMICS International

Дом О нас Открытый доступ Журналы Поиск по теме Журнал открытого доступа Acta Rheumatologica Журнал открытого доступа Достижения в профилактике рака Журнал открытого доступа Американский журнал этномедицины Американский журнал фитомедицины и клинической терапии Обезболивание и реанимация: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Анатомия и физиология: текущие исследования Журнал открытого доступа Андрология и гинекология: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Андрология — открытый доступ Журнал открытого доступа Анестезиологические коммуникации Ангиология: открытый доступ Журнал открытого доступа Летопись инфекций и антибиотиков Журнал открытого доступа Архивы исследований рака Журнал открытого доступа Архив расстройств пищеварения Архивы медицины Журнал открытого доступа Archivos de Medicina Журнал открытого доступа Рак груди: текущие исследования Журнал открытого доступа Британский биомедицинский бюллетень Журнал открытого доступа Отчет о слушаниях в Канаде Журнал открытого доступа Химиотерапия: открытый доступ Официальный журнал Итало-латиноамериканского общества этномедицины Хроническая обструктивная болезнь легких: открытый доступ Журнал открытого доступа Отчеты о клинических и медицинских случаях Журнал клинической гастроэнтерологии Журнал открытого доступа Клиническая детская дерматология Журнал открытого доступа Колоректальный рак: открытый доступ Журнал открытого доступа Косметология и хирургия лица Журнал открытого доступа Акушерство и гинекология интенсивной терапии Журнал открытого доступа Текущие исследования: интегративная медицина Журнал открытого доступа Стоматологическое здоровье: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа Стоматология Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии Дерматология и дерматологические заболевания Журнал открытого доступа Отчеты о случаях дерматологии Журнал открытого доступа Диагностическая патология: открытый доступ Журнал открытого доступа Неотложная медицина: открытый доступ Официальный журнал Всемирной федерации обществ педиатрической интенсивной терапии и реанимации Эндокринология и диабетические исследования Гибридный журнал открытого доступа Эндокринология и метаболический синдром Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ Эндокринологические исследования и метаболизм Эпидемиология: открытый доступ Журнал открытого доступа Европейский журнал спорта и науки о физических упражнениях Доказательная медицина и практика Журнал открытого доступа Семейная медицина и медицинские исследования Журнал открытого доступа Лечебное дело: открытый доступ Журнал открытого доступа Гинекология и акушерство Журнал открытого доступа, Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ Отчет о гинекологии и акушерстве Журнал открытого доступа Лечение волос и трансплантация Журнал открытого доступа Исследования рака головы и шеи Журнал открытого доступа Гепатология и панкреатология Фитотерапия: открытый доступ Журнал открытого доступа Анализ артериального давления Журнал открытого доступа Информация о заболеваниях грудной клетки Журнал открытого доступа Информация о гинекологической онкологии Журнал открытого доступа Внутренняя медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа Международный журнал болезней органов пищеварения Журнал открытого доступа Международный журнал микроскопии Международный журнал физической медицины и реабилитации Журнал открытого доступа JOP.Журнал поджелудочной железы Журнал открытого доступа Журнал аденокарциномы Журнал открытого доступа Журнал эстетической и реконструктивной хирургии Журнал открытого доступа Журнал старения и гериатрической психиатрии Журнал артрита Журнал открытого доступа Журнал спортивного совершенствования Гибридный журнал открытого доступа Журнал автакоидов и гормонов Журнал крови и лимфы Журнал открытого доступа Журнал болезней крови и переливания Журнал открытого доступа, Официальный журнал Международной федерации талассемии Журнал исследований крови и гематологических заболеваний Журнал открытого доступа Журнал отчетов и рекомендаций по костям Журнал открытого доступа Журнал костных исследований Журнал открытого доступа Журнал исследований мозга Журнал клинических испытаний рака Журнал открытого доступа Журнал диагностики рака Журнал открытого доступа Журнал исследований рака и иммуноонкологии Журнал открытого доступа Журнал онкологической науки и исследований Журнал открытого доступа Журнал канцерогенеза и мутагенеза Журнал открытого доступа Журнал кардиологической и легочной реабилитации Журнал клеточной науки и апоптоза Журнал детства и нарушений развития Журнал открытого доступа Журнал детского ожирения Журнал открытого доступа Журнал клинических и медицинских тематических исследований Журнал клинической и молекулярной эндокринологии Журнал открытого доступа Журнал клинической анестезиологии: открытый доступ Журнал клинической иммунологии и аллергии Журнал открытого доступа Журнал клинической микробиологии и противомикробных препаратов Журнал клинических респираторных заболеваний и ухода Журнал открытого доступа Журнал коммуникативных расстройств, глухих исследований и слуховых аппаратов Журнал открытого доступа Журнал врожденных заболеваний Журнал контрацептивных исследований Журнал открытого доступа Журнал стоматологической патологии и медицины Журнал диабета и метаболизма Официальный журнал Европейской ассоциации тематической сети по биотехнологиям Журнал диабетических осложнений и медицины Журнал открытого доступа Журнал экологии и токсикологии Журнал открытого доступа Журнал судебной медицины Журнал открытого доступа Журнал желудочно-кишечной и пищеварительной системы Журнал открытого доступа Журнал рака желудочно-кишечного тракта и стромальных опухолей Журнал открытого доступа Журнал генитальной системы и заболеваний Гибридный журнал открытого доступа Журнал геронтологии и гериатрических исследований Журнал открытого доступа Журнал токсичности и болезней тяжелых металлов Журнал открытого доступа Журнал гематологии и тромбоэмболических заболеваний Журнал открытого доступа Журнал гепатита Журнал открытого доступа Журнал гепатологии и желудочно-кишечных расстройств Журнал открытого доступа Журнал ВПЧ и рака шейки матки Журнал открытого доступа Журнал гипертонии: открытый доступ Журнал открытого доступа, Официальный журнал Словацкой лиги против гипертонии Журнал визуализации и интервенционной радиологии Журнал открытого доступа Журнал интегративной онкологии Журнал открытого доступа Журнал почек Журнал открытого доступа Журнал лейкемии Журнал открытого доступа Журнал печени Журнал открытого доступа Журнал печени: болезни и трансплантация Гибридный журнал открытого доступа Журнал медицинской и хирургической патологии Журнал открытого доступа Журнал медицинских диагностических методов Журнал открытого доступа Журнал медицинских имплантатов и хирургии Журнал открытого доступа Журнал медицинской онкологии и терапии Журнал медицинской физики и прикладных наук Журнал открытого доступа Журнал медицинской физиологии и терапии Журнал медицинских исследований и санитарного просвещения Журнал медицинской токсикологии и клинической судебной медицины Журнал открытого доступа Журнал метаболического синдрома Журнал открытого доступа Журнал микробиологии и патологии Журнал молекулярной гистологии и медицинской физиологии Журнал открытого доступа Журнал молекулярной патологии и биохимии Журнал морфологии и анатомии Журнал молекулярно-патологической эпидемиологии MPE Журнал открытого доступа Журнал неонатальной биологии Журнал открытого доступа Журнал новообразований Журнал открытого доступа Журнал нефрологии и почечных заболеваний Журнал открытого доступа Журнал нефрологии и терапии Журнал открытого доступа Журнал исследований нейроэндокринологии Журнал новых физиотерапевтов Журнал открытого доступа Журнал расстройств питания и терапии Журнал открытого доступа Журнал ожирения и расстройств пищевого поведения Журнал открытого доступа Журнал ожирения и терапии Журнал открытого доступа Журнал терапии ожирения и похудания Журнал открытого доступа Журнал ожирения и метаболизма Журнал одонтологии Журнал онкологической медицины и практики Журнал открытого доступа Журнал онкологических исследований и лечения Журнал открытого доступа Журнал трансляционных исследований онкологии Журнал открытого доступа Журнал гигиены полости рта и здоровья Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии Журнал ортодонтии и эндодонтии Журнал открытого доступа Журнал ортопедической онкологии Журнал открытого доступа Журнал остеоартрита Журнал открытого доступа Журнал остеопороза и физической активности Журнал открытого доступа Журнал отологии и ринологии Гибридный журнал открытого доступа Журнал детской медицины и хирургии Журнал по лечению боли и медицине Журнал открытого доступа Журнал паллиативной помощи и медицины Журнал открытого доступа Журнал периоперационной медицины Журнал физиотерапии и физической реабилитации Журнал открытого доступа Журнал исследований и лечения гипофиза Журнал беременности и здоровья ребенка Журнал открытого доступа Журнал профилактической медицины Журнал открытого доступа Журнал рака простаты Журнал открытого доступа Журнал легочной медицины Журнал открытого доступа Журнал пульмонологии и респираторных заболеваний Журнал редких заболеваний: диагностика и терапия Журнал регенеративной медицины Гибридный журнал открытого доступа Журнал репродуктивной биомедицины Журнал сексуальной и репродуктивной медицины подписка Журнал спортивной медицины и допинговых исследований Журнал открытого доступа Журнал стероидов и гормонологии Журнал открытого доступа Журнал хирургии и неотложной медицины Журнал открытого доступа Журнал хирургии Jurnalul de Chirurgie Журнал открытого доступа Журнал тромбоза и кровообращения: открытый доступ Журнал открытого доступа Журнал заболеваний щитовидной железы и терапии Журнал открытого доступа Журнал традиционной медицины и клинической натуропатии Журнал открытого доступа Журнал травм и лечения Журнал открытого доступа Журнал травм и интенсивной терапии Журнал исследований опухолей Журнал открытого доступа Журнал исследований и отчетов по опухолям Журнал открытого доступа Журнал сосудистой и эндоваскулярной терапии Журнал открытого доступа Журнал сосудистой медицины и хирургии Журнал открытого доступа Журнал женского здоровья, проблем и ухода Гибридный журнал открытого доступа Журнал йоги и физиотерапии Журнал открытого доступа, Официальный журнал Федерации йоги России и Гонконгской ассоциации йоги La Prensa Medica Контроль и ликвидация малярии Журнал открытого доступа Материнское и детское питание Журнал открытого доступа Медицинские и клинические обзоры Журнал открытого доступа Медицинская и хирургическая урология Журнал открытого доступа Отчеты о медицинских случаях Журнал открытого доступа Медицинские отчеты и примеры из практики в открытом доступе Нейроонкология: открытый доступ Журнал открытого доступа Медицина труда и здоровье Журнал открытого доступа Радиологический журнал OMICS Журнал открытого доступа Отчеты о онкологии и раковых заболеваниях Журнал открытого доступа Здоровье полости рта и лечение зубов Журнал открытого доступа Официальный журнал Лондонской школы лицевой ортотропии Отчеты о заболеваниях полости рта Журнал открытого доступа Ортопедическая и мышечная система: текущие исследования Журнал открытого доступа Отоларингология: открытый доступ Журнал открытого доступа Заболевания поджелудочной железы и терапия Журнал открытого доступа Педиатрическая помощь Журнал открытого доступа Скорая педиатрическая помощь и медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа Педиатрия и медицинские исследования Педиатрия и терапия Журнал открытого доступа Пародонтология и протезирование Журнал открытого доступа Психология и психиатрия: открытый доступ Реконструктивная хирургия и анапластология Журнал открытого доступа Отчеты в журнале «Рак и лечение» Отчеты в маркерах заболеваний Отчеты в исследованиях щитовидной железы Репродуктивная система и сексуальные расстройства: текущие исследования Журнал открытого доступа Исследования и обзоры: Journal of Dental Sciences Журнал открытого доступа Исследования и обзоры: медицинская и клиническая онкология Исследования и отчеты в гастроэнтерологии Журнал открытого доступа Исследования и отчеты в области гинекологии и акушерства Кожные заболевания и уход за кожей Журнал открытого доступа Хирургия: Текущие исследования Официальный журнал Европейского общества эстетической хирургии Трансляционная медицина Журнал открытого доступа Травмы и неотложная помощь Журнал открытого доступа Тропическая медицина и хирургия Журнал открытого доступа Универсальная хирургия Журнал открытого доступа Всемирный журнал фармакологии и токсикологии

Устойчивость Enterococcus faecalis у педиатрических пациентов, получающих постоянную антибиотикопрофилактику рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей

Вернуться к программе 2018

---

Enterococcus faecalis Персистентность у педиатрических пациентов, получающих постоянную антибиотикопрофилактику от рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей
Саманта Уайтсайд, PhD ¹ , Шеннон Сени, бакалавр наук ² , Питер ^{, доктор медицины 31199 Грегор Рид, доктор медицины 2 , Джереми Бертон, доктор медицины 2 , Сумит Дэйв, доктор медицины 3 .
1 Университет Западного Онтарио, Департамент микробиологии и иммунологии, Лондон, Онтарио, Канада, 2 Научно-исследовательский институт здоровья Лоусона, Лондон, Онтарио, Канада, 3 Лондонский центр медицинских наук, Лондон, Онтарио, Канада.}

Предпосылки
Использование непрерывной антибиотикопрофилактики (ВП) у детей с рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей (РУТИ) является спорным вопросом. Enterococcus faecalis , является одной из частых причин ИМП, однако патогенез энтерококковой инфекции в моче недостаточно изучен.Учитывая внутреннюю устойчивость E. faecalis к противомикробным препаратам, мы предположили, что E. faecalis будет преобладать в моче педиатрических пациентов с РУТИ, и краткосрочная ВП не уничтожит эти бактерии.
Методы
Мы провели проспективное когортное исследование с участием педиатрических пациентов с ИМП в анамнезе (> 2 ИМП с подтвержденной лихорадочной культурой за 6 месяцев до включения в исследование) без анатомических аномалий (отрицательные УЗИ и VCUG) в период с 2014 по 2016 год.Пациенты были разделены на две группы по усмотрению родителей, которым была предоставлена ​​возможность выбрать ВП (триметоприм-сульфаметоксазол или нитрофурантоин в течение 6 месяцев) или наблюдение в соответствии со стандартной клинической практикой. Обе группы получали стандартное лечение ассоциированной дисфункции мочевого пузыря и кишечника. Образцы мочи при первом мочеиспускании и в середине потока были собраны на исходном уровне и с трехмесячными интервалами в течение одного года. Соответствующие по возрасту здоровые люди из контрольной группы предоставили образцы мочи в один момент времени. Бактериальный посев образцов мочи был завершен, и цитокины мочи были определены количественно. In vitro , прикрепление клинических штаммов E. faecalis и E. coli к линии эпителиальных клеток мочевого пузыря человека определяли в присутствии и в отсутствие TMP / SMX или нитрофурантоина. Транскрипционный ответ E. faecalis на нитрофурантоин оценивали с помощью количественной ОТ-ПЦР.
Результаты
Хотя ни у одного из пациентов не было симптомов во время сбора образцов, 19% образцов мочи соответствовали диагностическому пороговому значению для ИМП (10 ⁵ бактерий одного вида), что свидетельствует о бессимптомной бактериурии.Количество жизнеспособных микроорганизмов E. faecalis существенно не отличалось между RUTI и здоровым контролем, в то время как нагрузка E. coli была значительно выше у пациентов с RUTI (p <0,0001). Энтерококки были значительно более подвержены выделению от пациентов с RUTI (p = 0,04) по сравнению с контрольной группой. Профилактика антибиотиками опосредовала небольшое снижение уропатогенной нагрузки; однако количество бактерий вернулось к уровням до ВП в течение 6 месяцев после прекращения ВП. Оценка цитокинов в моче показала, что уровни IL-6 были значительно выше в контрольной группе по сравнению с группой RUTI на исходном уровне (p = 0.03). Мы отметили значительное увеличение прикрепления E. faecalis к уротелиальным клеткам в присутствии нитрофурантоина (P = 0,0001), что не коррелировало с повышенной экспрессией генов, участвующих в прикреплении энтерококков.
Выводы
Это исследование демонстрирует присутствие энтерококков в моче бессимптомных здоровых пациентов и педиатрических пациентов с RUTI, предполагая, что эти бактерии могут быть частью нормального микробиома мочи. CAP вызывает временное снижение бактериальной нагрузки в моче, но в конце терапии счетчики возвращаются к уровням до CAP.Наши данные также указывают на то, что бактерии могут мешать работе врожденной иммунной системы, поскольку уровень ИЛ-6 был ниже в моче пациентов с РУТИ. Кроме того, ВП с использованием нитрофурантоина увеличивает прикрепление энтерококковых бактерий, что может привести к рецидиву энтерококковых ИМП после прекращения ВП. Эти данные вызывают вопросы о применении нитрофурантоина для профилактики энтерококковой инфекции RUTI у детей.

---

Вернуться к программе 2018

Выживание, распространение и перемещение Enterococcus faecalis и последствия для беременных мышей | Письма о микробиологии FEMS

Аннотация

Беременные матери восприимчивы к бактериальным инфекциям, которые могут поставить под угрозу здоровье матери и ребенка. Enterococcus faecalis — это широко распространенный вид, который встречается в продуктах питания, ресторанах и больницах, где беременные женщины часто подвергаются воздействию этой бактерии. Однако выживаемость, распространение, транслокация и соответствующее влияние E. faecalis не исследовались в период беременности, когда мать и плод восприимчивы к бактериальной инфекции. В этом исследовании флуоресцентный штамм E. faecalis был использован для отслеживания судьбы бактерии у беременных мышей.Было обнаружено, что при пероральном введении E. faecalis выживают и распространяются во всех областях кишечного тракта. Это также изменило структуру бактериального сообщества, значительно уменьшив разнообразие видов Lactobacillus , нарушив нормальную структуру и функцию кишечного барьера, что может способствовать транслокации бактерий в кровь, селезенку, плаценту и плод. Это может повлиять на рост и развитие плода и плаценты.

Введение

Enterococcus faecalis был широко изолирован из окружающей среды (Rathnayake et al., 2011), пищи (Giraffa, 2006) и пищеварительного тракта (Nueno-Palop & Narbad, 2011). В прошлом E. faecalis считались безвредными бактериями. Некоторые штаммы даже использовались в качестве пробиотиков для создания благоприятной среды кишечника (Franz et al. , 2011). Однако этот консенсус был поставлен под сомнение (Arias & Murray, 2012). Исследования показали, что E. faecalis является частым возбудителем внутрибольничных инфекций и может нарушать микробный баланс кишечника и вызывать воспаление (Balish & Warner, 2002; Kim et al., 2007; Lupp et al. , 2007).

Беременная особь восприимчива к патогенным инфекциям, которые могут поставить под угрозу здоровье матери и потомства, таким как цитомегаловирус (Скотт и др. , 2012), Trypanosoma cruzi (Duaso и др. , 2011) , Salmonella (Chattopadhyay et al. , 2010) и Listeria monocytogenes (Lamont et al. , 2011). Хотя E. faecalis был клинически обнаружен в грудном молоке, плаценте, околоплодных водах, пуповинной крови и меконии (Martí n et al., 2004; Jimé nez et al. , 2008), его влияние на беременных редко вызывало беспокойство. В предыдущих отчетах упоминалось, что E. faecalis способен преодолевать кишечный барьер и впоследствии вызывать заболевание (Wells et al. , 1990; Zeng et al. , 2004; Steck et al. , 2011). Однако выживаемость, распространение, транслокация и соответствующее влияние E. faecalis не исследовались в период беременности, когда мать и плод восприимчивы к бактериальной инфекции.Цель этого исследования — изучить влияние E. faecalis на беременных мышей.

Материалы и методы

Бактериальный штамм и состояние культуры

Enterococcus faecalis OG1RF с плазмидой pMV158GFP (устойчивость к тетрациклину, Tc ^R ) был предоставлен Мануэлем Эспинозой (Nieto & Espinosa, 2003). Штамм культивировали в среде TSB, содержащей 4 мкг / мл тетрациклина ^-1 . Клетки собирали и восстанавливали до 10 ⁹ КОЕ / мл ^-1 перед использованием.

Уход за животными

За животными ухаживали в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по уходу за животными (NIH, публикация № 85–23, 1996). Все процедуры проводились в соответствии с протоколами, предоставленными и утвержденными Комитетом по надзору за животными (номер разрешения 0064257), Университет Наньчан, Цзянси, Китай. Двенадцатинедельные беременные мыши KM были выведены в экспериментальном животноводческом центре Наньчанского университета. Мышей содержали в клетках при 25 ° C с 12-часовым циклом свет / темнота и ежедневно кормили водой и лабораторным рационом мышей.В конце эксперимента всех мышей умерщвляли с использованием CO ₂ .

Enterococcus faecalis оральная инфекция

Беременных мышей случайным образом распределяли в тестируемую или контрольную группу в первый день беременности. Контрольной группе перорально вводили фосфатно-солевой буфер (PBS), а тестовая группа получала 100 мкл бактериальной суспензии один раз в день в течение 19 дней (период беременности мышей составляет 21 день). За день до предполагаемой даты родов всех мышей умерщвляли и стерилизовали поверхность 75% этанолом.Кровь получали методом энуклеации глазного яблока. Животных вскрывали для сбора соответствующих органов, включая желудок, кишечник, сердце, мозг, печень, селезенку, почки, плаценту и плод.

Обнаружение

E. faecalis у беременных мышей

Все образцы тканей гомогенизировали в PBS, серийно разбавляли и распределяли на агаровой пластине TSB Tc ^R . Все планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24–48 ч до образования зеленых флуоресцентных колоний. И флуоресценция, и устойчивость к тетрациклину были использованы в качестве маркера обнаружения для E.faecalis OG1RF: pMV158GFP. Предварительные экспериментальные результаты показали, что в пищеварительном тракте беременных мышей также присутствовали другие устойчивые к тетрациклину бактерии.

Анализ ПЦР-ДГГЭ

Полную геномную ДНК экстрагировали методом взбивания шариков. ПЦР выполняли с использованием набора для ДНК-полимеразы Taq (CoWin Biotech Co., Ltd, Пекин, Китай). Все использованные праймеры перечислены во вспомогательной информации, таблица S1. Условия ПЦР были следующими: 94 ° C в течение 5 мин; 30 циклов при 94 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 30 с и 72 ° C в течение 30 с; затем 72 ° C в течение 10 мин.Продукты ПЦР анализировали с использованием 1,5% агарозных гелей.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) продуктов ПЦР выполняли с помощью универсальной системы обнаружения мутаций DCode ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Паттерны DGGE были нормализованы и проанализированы с помощью бионумерического программного обеспечения версии 2.0 (Applied Maths, Лондон, Великобритания). Во время обработки определялись разные дорожки, вычитался фон, во время нормализации компенсировались различия в интенсивности полос и вычислялась корреляционная матрица.Кластеризация проводилась с помощью корреляции Пирсона и метода UPGMA. Также были рассчитаны индексы разнообразия: богатство ( S ) определялось как количество полос на одной полосе, индекс Шеннона-Винера ( H ‘) рассчитывался как, где P _i — вероятность важности полосы в полосе, рассчитанное из N _i / N , где N _i — это максимальная высота полосы, а N — это сумма всех высот пиков, Ровность ) рассчитывалась по формуле, где (Yu & Morrison, 2004).Индекс Симпсона ( D ) рассчитывался как (Menezes Bento et al ., 2005). Наконец, каждую интересующую полосу вырезали из гелей, затем переносили в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 30 мкл ТЕ-буфера, и инкубировали в течение ночи при 4 ° C, чтобы позволить ДНК диффундировать в буфер. Собранные растворы ДНК впоследствии использовали для секвенирования. Последовательности сравнивали с использованием blast-n, предоставленного NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Гистопатология и иммуногистохимия

Небольшие кусочки подвздошной, слепой и толстой кишки вырезали и фиксировали в 10% формалине.Эти образцы были обезвожены и залиты парафином. Затем были вырезаны срезы ткани толщиной 5 мкм. Эти срезы переносили на чистые предметные стекла, сушили в течение ночи и хранили при комнатной температуре до использования. Установленные срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Для патологической оценки шесть полей для каждого образца были исследованы и оценены в соответствии с методом, описанным Yang et al . (2013).

Антиген был получен в 0.01 М солевой раствор цитрата натрия с помощью микроволнового излучения. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали и визуализировали с использованием системы обнаружения Dako REAL EnVision ™, пероксидаза / DAB, кролик / мышь (K5007, Dako, Glostrup, Дания). Анти-E-кадгерин (sc-8426) 1: 200 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) использовали в качестве первичного антитела; биотинилированный козий анти-кроличий IgG служил вторичным антителом, а стрептавидин-пероксидаза хрена, входящая в набор, использовалась для передачи сигнала. Впоследствии срезы фотографировали с помощью микроскопа (Nikon Corp., Токио, Япония), а результаты были проанализированы с помощью Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MA). Средняя оптическая плотность (MOD) (интегрированная оптическая плотность / площадь) была использована для расчета уровней экспрессии E-кадгерина в тканях.

Статистический анализ

Если не указано иное, все эксперименты повторяли в трех экземплярах. Все данные были проанализированы с помощью Sigma Plot 11.0 (Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния) и spss версии 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс).

Результаты

Распределение и перемещение жизнеспособных флуоресцентных

E. faecalis у беременных мышей

Как показано на рис. 1а, жизнеспособные флуоресцентные E. faecalis в разных областях пищеварительного тракта сильно различались. Не было обнаружено жизнеспособных флуоресцирующих E. faecalis из желудка, что позволяет предположить, что E. faecalis OG1RF не смог колонизировать эту область. Однако числа флуоресцирующих E.faecalis из толстой кишки составляли ≥ 5,6 ± 0,4 log ₁₀ КОЕ г ^-1 . Количество клеток в слепой кишке колебалось от 5,6 ± 0,4 до 6,8 ± 0,2 log ₁₀ КОЕ г ^-1 . Количество клеток в тонкой кишке было различным. У трех из пяти беременных мышей количество клеток варьировалось от 3,8 ± 0,2 до 4,0 ± 0,4 log ₁₀ КОЕ г ^-1 , но целевые бактерии не были обнаружены в тонком кишечнике двух других мышей. В целом обследование показало, что перорально вводили E.faecalis OG1RF может выживать и распространяться через весь кишечник, особенно через слепую кишку.

Исследование флуоресценции Enterococcus faecalis у беременных мышей. (а) Количество флуоресцирующих E. faecalis , которые колонизировали различные области пищеварительного тракта беременных мышей. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение. (b) Количество флуоресцирующих E. faecalis , транслоцированных в различные ткани беременных мышей. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение.Н.Д., не обнаружено.

Исследование флуоресценции Enterococcus faecalis у беременных мышей. (а) Количество флуоресцирующих E. faecalis , которые колонизировали различные области пищеварительного тракта беременных мышей. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение. (b) Количество флуоресцирующих E. faecalis , транслоцированных в различные ткани беременных мышей. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение. Н.Д., не обнаружено.

Рисунок 1b показывает, что флуоресцирующие E. faecalis были обнаружены в различных тканях, что свидетельствует о способности перорально вводимых бактерий перемещаться.В целом, жизнеспособных флуоресцирующих E. faecalis не было обнаружено в головном мозге, сердце, печени или почках. Однако он был обнаружен в крови, селезенке, плаценте и плода. Бактерии в крови колебались от 2,1 ± 0,1 до 2,3 ± 0,3 log ₁₀ КОЕ / мл ^-1 , а в селезенке от 2,4 ± 0,4 до 2,7 ± 0,4 log ₁₀ КОЕ г ^-1 . Кроме того, в плаценте двух мышей было обнаружено относительно низкое количество флуоресцирующих E. faecalis (≤ 1,9 ± 0,2 Log ₁₀ КОЕ г ^-1 ).Более того, у одной мыши у ее плода наблюдали несколько жизнеспособных флуоресцентных E. faecalis .

Влияние перорального введения

E. faecalis на разнообразие бактериального сообщества слепой кишки

Изменения показателей для нормальной микробиоты и видов Lactobacillus определяли с помощью ПЦР-DGGE. На рисунке S1 показано, что индекс сходства между контрольной и обработанной группами составлял 0,50–0,70 и 0,28–0,40 соответственно. На рис.2б, индексы сходства для вида Lactobacillus составили 0,45–0,70 и 0,24–0,49. Как правило, эти результаты показывают, что бактериальное сообщество в слепой кишке относительно стабильно, но резко изменилось при пероральном введении E. faecalis .

Влияние перорального введения Enterococcus faecalis на сообщество Lactobacillus у беременных мышей на микробиоту слепой кишки. (а) Lactobacillus видоспецифических отпечатков пальцев ПЦР-DGGE микробиоты слепой кишки у беременных мышей.(б) Дендрограмма внутригруппового сходства профилей DGGE микробиоты слепой кишки у беременных мышей. Сходство было рассчитано с использованием корреляции Пирсона, а кластеризация — с помощью UPGMA.

Воздействие перорального введения Enterococcus faecalis на сообщество Lactobacillus у микробиоты слепой кишки беременных мышей. (а) Lactobacillus видоспецифических отпечатков пальцев ПЦР-DGGE микробиоты слепой кишки у беременных мышей. (б) Дендрограмма внутригруппового сходства профилей DGGE микробиоты слепой кишки у беременных мышей.Сходство было рассчитано с использованием корреляции Пирсона, а кластеризация — с помощью UPGMA.

На основании ПЦР-DGGE, доминирующими бактериями в слепой кишке контрольных беременных мышей были Proteobacterium ( vc-a ), некультивируемые бактерии ( vc-b ), Lachnospiraceae ( vc-c. ), Bacteroidales ( vc-d ), некультивируемые бактерии ( vc-e ) и Gammaproteobacterium ( vc-f ), как показано в таблице 1.Однако после перорального заражения E. faecalis , Lachnospiraceae ( vc-g ) оказались доминирующими у трех обработанных мышей, а некультивируемые бактерии ( vc-h ) стали доминирующими бактериями в трех других. леченных мышей; vc-d , соответствующий Bacteroidales , либо уменьшился, либо исчез (Таблица 1). Кроме того, не было обнаружено значительных различий в разнообразии структур сообщества нормальной микробиоты (Таблица S2).Доминантными Lactobacillus у контрольных беременных мышей были Lactobacillus johnsonii ( lc-a ) и Lactobacillus sp. ( LC-B, C и D ). У подопытных животных L. johnsonii ( lc-e ), Lactobacillus reuteri ( lc-f ) и Lactobacillus gasseri ( lc-g ) были зарегистрированы как доминирующие виды (Таблица 1 ). Более того, мы обнаружили, что структурное разнообразие Lactobacillus (богатство и индекс Шеннона-Винера) в тестовой группе было значительно уменьшено (Таблица S2).Следовательно, результаты подтверждают значительный эффект перорального введения E. faecalis на разнообразие слепой кишки.

Влияние перорального введения

E. faecalis на структуру и функцию кишечника

Репрезентативные гистологические микрофотографии подвздошной, слепой и толстой кишки показаны на рис. 3a – c соответственно. Гистологический анализ показал, что несколько повреждений (повреждения крипт, уменьшение бокаловидных клеток и эпителиальные эрозии) были обнаружены в эпителии обработанных мышей.Эти результаты указывают на возможное повреждение в результате перорального введения E. faecalis беременным мышам.

Гистологический анализ кишечника беременных мышей, связанный с перорально введенным Enterococcus faecalis . Типичные срезы ткани, окрашенные на H&E, показаны из (а) подвздошной кишки, (б) слепой кишки и (в) толстой кишки. Исходное увеличение: × 200. (d) Гистологическая оценка кишечника представлена ​​в виде средних значений ± стандартное отклонение для пяти мышей на группу.** Значимая разница ( P <0,01).

Гистологический анализ кишечника беременных мышей, связанный с пероральным введением Enterococcus faecalis . Типичные срезы ткани, окрашенные на H&E, показаны из (а) подвздошной кишки, (б) слепой кишки и (в) толстой кишки. Исходное увеличение: × 200. (d) Гистологическая оценка кишечника представлена ​​в виде средних значений ± стандартное отклонение для пяти мышей на группу. ** Значимая разница ( P <0,01).

Типичные микрофотографии подвздошной, слепой и толстой кишки, иммуноокрашенных на Е-кадгерин, показаны на рис.4а – в соответственно. MOD срезов ткани использовали для количественной оценки экспрессии E-кадгерина в кишечнике (рис. 4d). Результаты показали, что MOD обработанной подвздошной кишки (75,4 ± 11,0) был значительно меньше контроля (93,3 ± 6,3). Аналогично, по сравнению с контролем (59,1 ± 7,4), MOD обработанной слепой кишки (36,7 ± 12,9) значительно снизился. MOD контрольной толстой кишки был 54,6 ± 9,2, что значительно выше, чем MOD обработанной толстой кишки (37,6 ± 7,8). Эти результаты показали, что присутствие E-кадгерина было значительно снижено в кишечнике беременных мышей после перорального заражения E.faecalis . Следовательно, можно сделать вывод, что пероральное введение E. faecalis способствовало нарушению эпителиальной барьерной функции беременных женщин.

Эффекты экспрессии E-кадгерина в кишечнике беременных мышей, связанные с пероральным введением Enterococcus faecalis . Типичные срезы ткани с иммуноокрашиванием Е-кадгерином показаны из (а) подвздошной кишки, (б) слепой кишки и (в) толстой кишки. Исходное увеличение: × 200.(d) MOD иммуноокрашивания кишечника E-кадгерином представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение для пяти мышей на группу. Достоверная разница * P <0,05, ** P <0,01.

Эффекты экспрессии E-кадгерина в кишечнике беременных мышей, связанные с пероральным введением Enterococcus faecalis . Типичные срезы ткани с иммуноокрашиванием Е-кадгерином показаны из (а) подвздошной кишки, (б) слепой кишки и (в) толстой кишки. Исходное увеличение: × 200. (d) MOD иммуноокрашивания кишечника E-кадгерином представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение для пяти мышей на группу.Достоверная разница * P <0,05, ** P <0,01.

Влияние перорального введения

E. faecalis на рост плода и плаценты мышей

Размер плода резко уменьшился, когда беременным мышам перорально вводили E. faecalis (рис. 5а). Вес плода составлял всего 1,22 ± 0,13 г в обработанной группе по сравнению с 1,63 ± 0,30 г в контроле, т.е. снижение на 25,6% (рис. 5а). Масса плаценты также снизилась с 0.13 ± 0,02 г в контрольной группе до 0,11 ± 0,01 г в группе, обработанной E. faecalis , со снижением на 15,4% (рис. 5b). Следовательно, результаты показывают, что пероральное введение E. faecalis может замедлить рост и развитие плода и плаценты.

Эффекты роста плода и плаценты мыши, связанные с пероральным введением Enterococcus faecalis . (а) Вес плода. (б) Вес плаценты. Значимая разница * P <0.05, ** P <0,01.

Эффекты роста плода и плаценты мыши, связанные с пероральным введением Enterococcus faecalis . (а) Вес плода. (б) Вес плаценты. Достоверная разница * P <0,05, ** P <0,01.

Обсуждение

Выживание и колонизация кишечника является критическим условием для сохранения и функционирования в кишечнике патогенов пищевого происхождения и комменсальных бактерий (Shi & Walker, 2004).Понимание судьбы бактерий в пищеварительном тракте может пролить свет на то, где, как и какую роль играет бактерия. В этом исследовании мы исследовали распределение E. faecalis на различных участках беременных мышей (рис. 1а). Наши результаты показывают, что E. faecalis смог выжить в кишечном тракте и сохраниться среди кишечной микробиоты беременных мышей.

Эффекты выживания и распределения в кишечнике после перорального приема изучали с помощью ПЦР-DGGE.ПЦР-DGGE — это эффективный метод снятия отпечатков пальцев для оценки распределения и динамики микробного сообщества (Hawkins & Purdy, 2007). Согласно результатам, пероральный прием E. faecalis изменил распределение бактериального сообщества. Примечательно, что разнообразие видов Lactobacillus (обозначенное индексами богатства и Шеннона-Винера) значительно снизилось у мышей, получавших E. faecalis (таблица S2). Это изменение может снизить защиту кишечника хозяина и привести к разрушению нормальной структуры и функции кишечного тракта (Round & Mazmanian, 2009; Sekirov et al., 2010).

Было также исследовано действие E. faecalis на кишечник беременных мышей. Результаты гистологических исследований кишечника беременных мышей, которым перорально вводили E. faecalis , показали патологические изменения (рис. 3). В прошлом несколько сообщений показали, что E. faecalis вызывает воспаление толстой кишки и хронический колит у мышей с интерлейкином-10 ^{— / —} , но не у мышей дикого типа (Kim et al. , 2005).Более того, E. faecalis , как было показано, влияет на экспрессию E-cadherin посредством межклеточной адгезии и функции эпителиального барьера (Steck et al. , 2011). Аналогичным образом, результаты показали, что экспрессия E-кадгерина во всех областях кишечника была значительно снижена по сравнению с контролем (фиг. 4). Это означает, что присутствие E. faecalis нарушает целостность эпителиального барьера во время беременности у мышей.

На основании собранных результатов, перорально E.faecalis был перемещен в кровь и селезенку (рис. 1б). Кроме того, E. faecalis вызывал изменения популяции бактериального сообщества и нарушал нормальную структуру и функцию кишечника, что позволило E. faecalis переместиться в кровоток и селезенку. Бактериальная транслокация признана важным фактором, способствующим возникновению и развитию заболеваний (Van Leeuwen et al ., 1994). В 1990 году Wells и др. .наблюдали транслокацию E. faecalis по кишечному тракту мышей. Цзэн и др. . (2004, 2005) сравнили способность к транслокации среди нескольких штаммов E. faecalis и продемонстрировали, что epa и желатиназа важны для его транслокации. Цуда и Шигемацу отметили, что термически поврежденные мыши восприимчивы к транслокации E. faecalis , которая впоследствии вызывает сепсис (Tsuda et al. , 2008; Shigematsu et al., 2012). Это исследование показало, что E. faecalis , введенные перорально, выживают в кишечнике, перемещаются и вызывают бактериемию у беременных мышей.

Кроме того, помимо причинения материнских заболеваний, транслокация E. faecalis , даже с относительно низкой частотой, наблюдалась в материнской плаценте и плодах (рис. 1b). Было высказано предположение, что они влияют на рост и развитие плода (Rezeberga et al. , 2008). В соответствии с нашими предположениями, результаты показали, что материнская E.faecalis снизил вес плода и плаценты (рис. 5).

Таким образом, наши результаты показали, что E. faecalis , введенные перорально, могут выжить в кишечнике беременных мышей. Эти E. faecalis могут вызывать изменение внутренней структуры бактериального сообщества, особенно разнообразия видов Lactobacillus . Кроме того, взаимодействие бактерий E. faecalis с хозяином может нарушить целостность кишечного барьера, что, возможно, способствовало транслокации E.faecalis в кровь, селезенку, плаценту и плод. Это может задержать рост и развитие плода и плаценты.

Благодарности

Этот исследовательский проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (NSF31170091, 31000048), Программой обучения академических и технических лидеров для основных субъектов провинции Цзянси (2009) и исследовательской программой Государственной ключевой лаборатории пищевых наук и технологий Наньчанского университета (SKLF-TS-200916, SKLF-MB-201002).

Список литературы

(

2012

)

Рост числа энтерококков : выше устойчивости к ванкомицину

.

Nat Rev Microbiol

10

:

266

—

278

.

(

2002

)

Enterococcus faecalis вызывает воспалительное заболевание кишечника у мышей с нокаутом интерлейкина-10

.

Am J Pathol

160

:

2253

—

2257

.

(

2010

)

Salmonella enterica серовар Воспаление плаценты, вызванное Typhimurium, а не бактериальная нагрузка, коррелирует с патологией и смертельным исходом материнской болезни

.

Infect Immun

78

:

2292

—

2301

.

(

2011

)

Trypanosoma cruzi индуцирует апоптоз в ex vivo инфицированных ворсинах хориона человека

.

Плацента

32

:

356

—

361

.

(

2011

)

Энтерококки как пробиотики и их значение для безопасности пищевых продуктов

.

Int J Food Microbiol

151

:

125

—

140

.

(

2006

)

Энтерококки из пищевых продуктов

.

FEMS Microbiol Ред.

26

:

163

—

171

.

(

2007

)

Генотипическое распределение местного модельного микроорганизма вдоль эстуарного уклона

.

FEMS Microbiol Ecol

62

:

187

—

194

.

(

2008

)

Действительно ли меконий от здоровых новорожденных бесплоден?

Res Microbiol

159

:

187

—

193

.

(

2005

)

Вариабельные фенотипы энтероколита у мышей с дефицитом интерлейкина 10, моноассоциированные с двумя разными комменсальными бактериями

.

Гастроэнтерология

128

:

891

—

906

.

(

2007

)

Двойная ассоциация гнотобиотических мышей IL10 ^{— / —} с 2 непатогенными комменсальными бактериями вызывает агрессивный панколит

.

Воспаление кишечника

13

:

1457

—

1466

.

(

2011

)

Листериоз при беременности человека: систематический обзор

.

J Perinat Med

39

:

227

—

236

.

(

2007

)

Опосредованное хозяином воспаление разрушает кишечную микробиоту и способствует чрезмерному росту Enterobacteriaceae

.

Cell Host Microbe

2

:

119

—

129

.

(

2004

)

Комменсальная микрофлора грудного молока: новые перспективы пищевой бактериотерапии и пробиотиков

.

Trends Food Sci Technol

15

:

121

—

127

.

(

2005

)

Разнообразие микроорганизмов, продуцирующих биоповерхностно-активные вещества, выделенных из почв, загрязненных дизельным топливом

.

Microbiol Res

160

:

249

—

255

.

(

2003

)

Конструирование подвижной плазмиды pMV158GFP, производного pMV158, несущего ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок

.

Плазмида

49

:

281

—

285

.

(

2011

)

Оценка пробиотиков Enterococcus faecalis CP58, выделенных из кишечника человека

.

Int J Food Microbiol

145

:

390

—

394

.

(

2011

)

Разнообразие SNP Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium в водном пути Юго-Восточного Квинсленда, Австралия, и профили генов устойчивости к антибиотикам

.

BMC Microbiol

11

:

201

.

(

2008

)

Гистологическое воспаление плаценты и инфекции репродуктивного тракта у беременных из группы низкого риска в Латвии

.

Acta Obstet Gynecol Scand

87

:

360

—

365

.

(

2009

)

Микробиота кишечника формирует иммунные реакции кишечника во время здоровья и болезни

.

Nat Rev Immunol

9

:

313

—

323

.

(

2012

)

Цитомегаловирусная инфекция во время беременности с материнско-фетальной передачей вызывает смещение провоспалительных цитокинов в плаценте и околоплодных водах

.

J Инфекция Dis

205

:

1305

—

1310

.

(

2010

)

Микробиота кишечника в здоровье и болезнях

.

Physiol Rev

90

:

859

—

904

.

(

2004

)

Бактериальная колонизация и развитие защиты кишечника

.

Can J Gastroenterol

18

:

493

—

500

.

(

2012

)

Влияние антисмысловых олигодезоксинуклеотидов CCL2 на бактериальную транслокацию и последующий сепсис у сильно обгоревших мышей, орально инфицированных Enterococcus faecalis

.

Eur J Immunol

42

:

158

—

164

.

(

2011

)

Enterococcus faecalis Металлопротеиназа нарушает эпителиальный барьер и способствует воспалению кишечника

.

Гастроэнтерология

141

:

959

—

971

.

(

2008

)

Роль полиморфноядерных нейтрофилов в инфекционных осложнениях, вызванных Enterococcus faecalis , оральной инфекцией у термически травмированных мышей

.

Дж Иммунол

180

:

4133

—

4138

.

(

1994

)

Клиническое значение транслокации

.

Кишечник

35

:

S28

—

S34

.

(

1990

)

Доказательства транслокации Enterococcus faecalis через кишечник мыши

.

J Инфекция Dis

162

:

82

—

90

.

(

2013

)

Идентификация белка внешней мембраны Salmonella enterica серовара Typhimurium в качестве потенциальной вакцины-кандидата от сальмонеллеза у мышей

.

Микробы заражают

15

:

388

—

398

.

(

2004

)

Сравнение различных гипервариабельных участков генов rrs для использования в фингерпринтинге микробных сообществ с помощью ПЦР-денатурирующего градиентного гель-электрофореза

.

Appl Environ Microbiol

70

:

4800

—

4806

.

(

2004

)

Транслокация штаммов Enterococcus faecalis через монослой поляризованных человеческих энтероцитоподобных клеток T84

.

J Clin Microbiol

42

:

1149

—

1154

.

(

2005

)

Желатиназа важна для транслокации Enterococcus faecalis через поляризованные человеческие энтероцитоподобные клетки Т84

.

Infect Immun

73

:

1606

—

1612

.

Дополнительная информация

Дополнительную вспомогательную информацию можно найти в онлайн-версии этой статьи:

Рис.S1. Эффекты перорального введения E. faecalis OG1RF на бактериальное сообщество микробиоты слепой кишки беременных мышей.

Таблица S1. Праймеры, используемые в ПЦР-DGGE.

Таблица S2. Анализ разнообразия структуры сообщества микробиоты слепой кишки на рис. S1 и 2.

Заметки автора

© 2013 Федерация европейских микробиологических обществ. Опубликовано John Wiley & Sons Ltd. Все права защищены

Enterococcus faecalis способствует подавлению врожденного иммунитета и полимикробной катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей .

E. faecalis может подорвать или избежать иммуноопосредованного клиренса, хотя механизмы плохо изучены. В этом исследовании мы изучили опосредованных E. faecalis подрывов активации макрофагов. Мы наблюдали, что E. faecalis активно предотвращает передачу сигналов NF-κB в мышиных макрофагах RAW264.7 в присутствии агонистов Toll-подобных рецепторов и во время полимикробной инфекции Escherichia coli . E. faecalis и E. coli Коинфекция на мышиной модели катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей (CAUTI) привела к подавлению транскрипционного ответа макрофагов в мочевом пузыре по сравнению с E.coli только. Наконец, мы продемонстрировали, что совместная инокуляция E. faecalis с E. coli в катетеризованные мочевые пузыри значительно увеличила количество бактерий E. coli CAUTI. Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что подавление E. faecalis NF-κB-зависимых ответов в макрофагах способствует полимикробному патогенезу CAUTI.

Краткое содержание автора Синергетические полимикробные инфекции могут влиять как на тяжесть, так и на постоянство заболевания. Enterococcus faecalis и Escherichia coli часто совместно выделяются при полимикробных инфекциях мочевыводящих путей. Иммуномодуляция за счет одновременного заражения микробами может привести к созданию более благоприятной среды для патогенов, способных вызвать инфекцию. В настоящее время мы еще не понимаем, как эти микробы преодолевают иммунитет хозяина и вызывают полимикробные инфекции. Чтобы решить эту проблему, мы исследовали, как иммуносупрессивная функция E. faecalis может способствовать развитию острой инфекции.Мы определили, что E. faecalis способен подавлять макрофаги in vitro , несмотря на присутствие E. coli . Мы также продемонстрировали способность E. faecalis увеличивать титров E. coli in vivo для установления инфекции почек. Наши результаты открывают перспективу того, что E. faecalis может изменять иммунитет хозяина, повышая восприимчивость к другим уропатогенам.

Введение

Enterococcus faecalis — ранний колонизатор у младенцев и повсеместный член микробиома кишечника человека [1]. E. faecalis также связан с до 70% раневых инфекций, почти 10% инфекций кровотока и до 30% катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей (CAUTI) [2-5]. Чтобы успешно колонизировать и сохраняться в организме хозяина, патогены должны противостоять иммуно-опосредованным механизмам клиренса, модулировать их или уклоняться. E. faecalis задействует несколько стратегий сохранения в организме хозяина, включая образование биопленок, предотвращающих фагоцитоз иммунных клеток [6], и способность выживать в макрофагах и нейтрофилах в течение продолжительных периодов времени [7-11].

Клетки млекопитающих обнаруживают ассоциированные с патогенами молекулярные паттерны (PAMP) через рецепторы распознавания паттернов (PRR), чтобы запустить ядерный фактор-каппа B (NF-κB) -зависимую защиту хозяина. NF-κB контролирует транскрипцию воспалительных и иммуноассоциированных генов, включая цитокины и хемокины, регулирующие рекрутинг и активацию иммунных клеток в ответ на инфекцию [12]. E. faecalis Инфекция макрофагов при низкой множественности инфекции (MOI = 10) приводит к активации митоген-активированных протеинкиназ (MAPK) и NF-κB, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов [13].Однако некоторые штаммы E. faecalis , выделенные из желудочно-кишечного тракта здоровых младенцев, могут подавлять передачу сигналов MAPK и NF-κB, а также экспрессию IL-8 в эпителиальных клетках кишечника in vitro [14, 15].

В модели инфекции мочевыводящих путей (ИМП) мышей клеточный ответ на инфекцию E. faecalis в основном моноцитарный и не зависит от Toll-подобного рецептора (TLR) 2 [16]. В модели CAUTI наличие мочевого катетера само по себе вызывает сильный провоспалительный ответ в мочевом пузыре, состоящем из нейтрофилов и клеток, происходящих из моноцитов [17-19].Инфекция катетеризованных мочевых пузырей E. faecalis приводит к развитию связанных с катетером биопленок с высоким титром и инфекции мочевого пузыря, несмотря на наличие сильной воспалительной реакции, вызванной катетеризацией (19). Более того, в ходе лечения E. faecalis CAUTI количество как неактивированных, так и активированных макрофагов, связанных с мочевым пузырем, было уменьшено по сравнению с катетеризованными неинфицированными животными [17]. Вместе эти наблюдения предполагают, что E.faecalis может подорвать иммуноопосредованное убийство, чтобы сохраняться в инфицированном мочевом пузыре.

Во время ИМП и ОВТИ E. faecalis часто является частью полимикробного сообщества [20-22]. E. faecalis может способствовать полимикробной инфекции за счет повышения устойчивости коинфекционных организмов, таких как P. aeruginosa и P. mirabilis , к удалению антибиотиками [23, 24]. Полимикробная инфекция, вызываемая E. faecalis и P. aeruginosa , чаще приводит к обострению пиелонефрита, чем мономикробная инфекция [23]. E. faecalis и уропатогенный Escherichia coli (UPEC) также часто выделяются вместе во время CAUTI [25], однако взаимосвязь между этими патогенами и влиянием на патогенез неизвестна. Учитывая частоту, с которой E. faecalis обнаруживается среди полимикробных инфекций, и что E. faecalis могут модулировать иммунный ответ хозяина в катетеризованном мочевом пузыре, мы проверили гипотезу о том, что иммуномодуляция E. faecalis способствует полимикробному CAUTI.Мы обнаружили, что E. faecalis активно разрушает E. coli -опосредованную активацию NF-κB и продукцию провоспалительных цитокинов в макрофагах RAW264.7 in vitro и профили провоспалительной экспрессии, связанные с макрофагами в катетеризованных мочевых пузырях в vivo, , что приводит к более высокому титру E. coli CAUTI.

Результаты

Live

E. faecalis предотвращает LPS- или LTA-опосредованную активацию NF-κB в макрофагах RAW

E.faecalis во время CAUTI вызывает моноцитарную инфильтрацию [16]. Чтобы определить, являются ли E. faecalis иммуномодулированными клетками, происходящими из моноцитов, таких как макрофаги, мы оценили передачу сигналов NF-κB в мышиных макрофагах RAW-264.7 через 6 часов после инфицирования (hpi). Как штамм E. faecalis OG1RF (рис. 1A) , так и штамм с множественной лекарственной устойчивостью V583 (рис. S1A) активировали NF-κB при низкой множественности инфекции (MOI), как сообщалось ранее [13]. Напротив, ни E.faecalis , ни OG1RF, ни V583 не активировали передачу сигналов NF-κB при высоких MOI. Мы одновременно отслеживали высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатанты культур, чтобы гарантировать, что отсутствие активации NF-κB не было результатом гибели клеток при высоких значениях MOI, и не наблюдали увеличения высвобождения LDH при любом из значений MOI, использованных в этом исследовании (Рис. 1B и Рис. S1B, Рис. S1) .

Рис. 1. E. faecalis предотвращает активацию макрофагов, управляемую NF-κB.

Мышиные макрофаги RAW 267.4 были инфицированы живыми E.faecalis OG1RF отдельно или одновременно с лечением либо LPS (100 нг / мл), либо LTA (100 нг / мл) при указанной MOI в течение 6 часов перед измерением активности репортера SEAP, управляемой NF-κB, и цитотоксичности (активности LDH) . (A) управляемая NF-κB репортерная активность SEAP и (B) активность LDH макрофагов RAW 264.7, инфицированных только E. faecalis . (C) управляемая NF-κB репортерная активность SEAP и (D) активность ЛДГ в присутствии E. faecalis и LPS. (E) управляемая NF-κB репортерная активность SEAP и (F) активность ЛДГ в присутствии E.faecalis и LTA. (G) NF-κB-управляемая репортерная активность SEAP и (H) активность ЛДГ при стимуляции убитыми нагреванием E. faecalis при указанной MOI, инфекционном супернатанте или супернатантах бактериальной культуры с или без LPS. Супернатанты культур после периода инфицирования собирали для анализов репортера SEAP и анализов LDH. Управляемые NF-κB репортерные анализы SEAP: воздействие одной среды (-) представляет фоновую репортерную активность NF-κB, а стимуляция LPS или LTA представляет собой положительный контроль репортерной активности.Анализы ЛДГ: обработка Тритоном-X служила в качестве положительного контроля (+) на гибель клеток. Данные объединены из 3 независимых экспериментов; средние значения нанесены на график, а полосы ошибок представляют стандартную ошибку среднего (SEM). Статистический анализ проводился с помощью одностороннего теста ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки, где * P <0,05, *** P <0,001, **** P <0,0001 по сравнению с одной средой (-) элементы управления; и где ^# P <0,05, ^## P <0.01, ^### P <0,001, ^#### P <0,0001 среди всех MOI по сравнению с MOI 100.

E. faecalis может ослаблять секрецию провоспалительных цитокинов в кишечном эпителии. клетки [15]. Чтобы определить, действительно ли E. faecalis активно предотвращает транскрипцию, опосредованную NF-κB, или просто не может индуцировать опосредованную NF-κB транскрипцию при высоких значениях MOI в макрофагах, мы проверили, может ли E. faecalis предотвратить активацию, управляемую NF-κB. в присутствии агонистов TLR, которые инициируют передачу сигналов NF-κB.Мы подвергали макрофаги воздействию липополисахарида (LPS) или липотейхоевой кислоты (LTA) одновременно с E. faecalis в течение 6 часов, количественно определяли как транскрипцию, опосредованную NF-κB, так и высвобождение LDH, и наблюдали дозозависимое ингибирование LPS- и LTA- индуцированная активация NF-κB с помощью E. faecalis (Фиг.1C, 1E и S1C Fig из S1 Fig) в отсутствие цитотоксичности (Fig 1D, 1F и S1D Fig from S1 Fig) .

Чтобы определить, связано ли отсутствие транскрипционного ответа NF-κB с геном E.faecalis , мы исследовали ответ макрофагов на убитые нагреванием E. faecalis или супернатанты бесклеточных бактерий из эквивалентов MOI в диапазоне от 100 до 1. Мы наблюдали, что убитые нагреванием E. faecalis активировали NF-κB при все MOI в обратном порядке по отношению к живым интактным клеткам (фиг.1G) в отсутствие цитотоксичности (фиг.1H) . Супернатанты от инфицированных макрофагов показали аналогичную активацию NF-κB, что и у живых клеток E. faecalis (рис. 1G) .Чтобы исключить, что активация NF-κB не была связана с цитокинами, секретируемыми макрофагами RAW-264.7 во время инфекции, мы также подвергали макрофаги воздействию супернатантов из культур бактерий, выращенных в отсутствие макрофагов. Супернатанты из бактериальных культур слабо активировали только NF-κB и не подавляли LPS-опосредованную индукцию активности NF-κB, за исключением MOI 100 (рис. 1G) . Вместе эти данные предполагают, что E. faecalis активно предотвращал активацию NF-κB посредством процесса, требующего термомодифицируемого фактора, который секретируется в супернатанты клеток во время совместного культивирования с макрофагами и продуцируется в отсутствие макрофагов только при очень высокий MOI.

E. faecalis подавляет продукцию NF-κB-зависимых цитокинов и хемокинов в макрофагах RAW

E. faecalis модулирует цитокины, такие как IL-8, TNFα и IL-1β, в эпителиальных клетках кишечника [13, 14] . К кишечным эпителиальным клеткам]. Чтобы выяснить, подавляет ли E. faecalis продукцию цитокинов в инфицированных макрофагах, мы измерили высвобождение различных цитокинов и хемокинов, экспрессия которых зависит от активации NF-κB, в отсутствие LPS.Мы наблюдали общее увеличение как про-, так и противовоспалительных цитокинов и хемокинов при MOI 10 и 1, подобное тому, которое наблюдается в обработанных LPS клетках (фиг. 2A, B) . Поразительно, что при MOI 100 мы наблюдали глобальное снижение экспрессии цитокинов, хемокинов и факторов роста по сравнению с MOI 10 или воздействием ЛПС (рис. 2A) . Более того, при MOI 100 мы наблюдали, что большинство аналитов (IFN- □, CCL11, CSF2, IL-4, IL-17, IL-12p40, IL-12p70, IL-2, IL-1β, CCL2, CXCL1, и IL-5) присутствовали на уровнях, аналогичных контрольному средству (фиг. 2A, B и S2A фиг. из S2 фиг.) .Анализ главных компонентов аналитов выявил, что профиль MOI 100 перекрывается с профилем неинфицированных макрофагов, что позволяет предположить, что аналиты не экспрессировались, несмотря на большее количество E. faecalis (фигура S2B из фигуры S2) . Следовательно, эти данные предполагают, что подавление E. faecalis активации NF-κB при высоком MOI привело к общему подавлению цитокинов и экспрессии хемокинов (фиг. 2) .

Рис. 2. E. faecalis подавляет продукцию NF-κB-зависимых цитокинов и хемокинов в макрофагах RAW.Макрофаги

RAW 267.4 были инфицированы живыми E. faecalis при указанной MOI. (A) График в виде паутины, показывающий кратность изменения цитокинов, хемокинов и факторов роста, обнаруженных в отфильтрованных супернатантах, собранных 6 hpi в изображенных условиях, по сравнению с контрольной средой. Данные были нормализованы относительно контрольной среды, представленной розовым цветом, для получения кратного изменения. (B) Тепловая карта, изображающая преобразование log ₂ абсолютных значений, измеренных в пг / мл указанных цитокинов, хемокинов и факторов роста.

E. faecalis ограничивает E. coli -опосредованная активация иммунитета во время инфицирования полимикробными RAW-макрофагами

Чтобы выяснить, способствует ли E. faecalis- подавление иммунитета полимикробным ИМП, мы сначала проверили его способность подавлять NF- Активность κB в присутствии E. coli in vitro . Мы определили, что макрофаги RAW инфицированы штаммом MG1655 E. coli K12 при MOI 1 или E. coli UTI89 при MOI 0.125 индуцировал активацию NF-κB (S3A и S3C фиг. Из S3 фиг.) в отсутствие цитотоксичности (S3B и S3D фиг. Из S3 фиг.) , тогда как более высокие MOI были токсичны для клеток млекопитающих (S3B и S3D фиг. Из S3 Рис) . Мы одновременно инфицировали макрофаги E. faecalis и E. coli при этих заранее определенных MOI и наблюдали, что, хотя оба штамма MG1655 и UTI89 E. coli индуцировали репортерную активность NF-κB, равную активности одного LPS. , E.faecalis предотвращал активность NF-κB, индуцированную E. coli , дозозависимым образом (Рис. 3) . На основании этого наблюдения мы предположили, что E. faecalis может аналогичным образом подавлять иммунный ответ хозяина in vivo .

Рис. 3. E. faecalis подавляет E. coli , индуцированную активацию иммунной системы in vitro .

Мышиные макрофаги RAW 267.4 стимулировали одновременно E. faecalis OG1RF и E.coli MG1655 перед измерением (A) управляемой NF-κB активности репортера SEAP и (B) активности ЛДГ. Макрофаги RAW 267.4 мыши были совместно инфицированы E. faecalis OG1RF и E. coli UTI89 перед измерением (C) управляемой NF-κB репортерной активности SEAP и (D) активности LDH. Управляемые NF-κB репортерные анализы SEAP: воздействие одной среды (-) представляет фоновую репортерную активность NF-κB, а стимуляция LPS представляет собой положительный контроль репортерной активности. Анализы ЛДГ: обработка Тритоном-X служила в качестве положительного контроля (+) на гибель клеток.Данные объединены из 3 независимых экспериментов. Статистический анализ выполняли с использованием однофакторного теста ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки, где *** P <0,001, **** P <0,0001 по сравнению с контролями только со средой (-); и где ^# P <0,05, ^### P <0,001, ^#### P <0,0001 среди всех MOI по сравнению с MOI 100.

E. faecalis ограничивает E. coli -опосредованная активация иммунитета во время смешанной инфекции

Чтобы исследовать, является ли E.faecalis влияет на передачу сигналов, связанных с иммунитетом in vivo , мы выполнили профили экспрессии РНК на целых мочевых пузырях через 24 часа после катетеризации и инфицирования. Мы сравнили моновидовую инфекцию E. coli UTI89 с коинфекцией E. coli UTI89 и E. faecalis OG1RF при соотношении посевного материала 1: 1. Из 15 501 детектируемого гена ( P _adj <0,05) 2 гена (0,013%) продемонстрировали повышенные уровни мРНК, а 53 гена (0.34%) продемонстрировали снижение уровней мРНК между коинфицированными мышами и моноинфицированными мышами. Из этих дифференциально экспрессируемых генов мы наблюдали, что 31 ген сопоставлен с терминами Gene Ontology (GO): ответ на внешний биотический стимул (GO: 0043207), ответ на другой организм (GO: 0051707), врожденный иммунный ответ (GO: 0045087), ответ на цитокин (GO: 0034097), ответ на биотический стимул (GO: 0009607), иммунный эффекторный ответ (GO: 0002252) и регуляция иммунного ответа (GO: 0050776) ), которые были значительно обогащены ( P _прил <0.01; Точный тест Фишера исправил 218 проверенных терминов; см. раздел «Методы») (Рис. 4A и Рис. 4B, Таблица из Таблицы S1).

Рис. 4. E. faecalis подавляет воспаление, вызванное E. coli , в катетеризованных мочевых пузырях мыши.

Самкам мышей C57BL / 6NTac были имплантированы катетеры в мочевой пузырь и инфицированы 10 ⁷ КОЕ E. coli UTI89 или 10 ⁷ КОЕ каждой из E. coli и E. faecalis в 1 : 1 смесь.Через 24 часа пузыри удаляли и экстрагировали РНК. (A) Бинарная матрица, показывающая связь между дифференциально экспрессируемыми генами (строки) и теми терминами (столбцы) онтологии генов (GOBP), обогащенными в анализе дифференциальной экспрессии между E. coli -инфицированными и полимикробно-инфицированными животными. Дифференциально экспрессируемые гены, которые не отображались на обогащенный терм GOBP, не показаны. Темные клетки указывают на гены, которые аннотированы термином GOBP, а светлые клетки указывают на то, что это не так.(B) Сводка дифференциальной экспрессии в наборе из 31 гена, показанном на (A). Дифференциальная экспрессия в каждом гене суммирована как среднее (черные точки) log ₂ отношения экспрессии между E. coli -инфицированными и полимикробно-инфицированными животными; где линия указывает предполагаемую стандартную ошибку среднего. (C) Чтобы проверить, может ли наблюдаемая дифференциальная экспрессия генов быть связана с данным типом клеток, определенным ImmGen, мы вычислили процент высших дифференциальных генов (повышенная регуляция в E.coli по сравнению с полимикробной инфекцией), которые помещаются в верхний 1% распределения оценки обогащения по типу клеток [66] (фиолетовые точки) по сравнению со 100 наборами из 50 генов, выбранными случайным образом (суммированными на графиках скрипки). желтым цветом; полоса показывает медианное значение). SP, стволовые клетки и клетки-предшественники; B, B клетки; ДК, дендритные клетки; МФ, макрофаги; МО, моноциты; GN, гранулоциты; Т4, CD4 + клетки; Т8, CD8 + клетки; NKT, естественные Т-клетки-киллеры; GDT, γδ Т-клетки; SC — стромальные клетки; NK, естественные клетки-киллеры.См. Соответствующие анализы в таблицах S1, S2. Эксперимент проводили дважды (n = 3 мыши на группу / эксперимент). Репрезентативные данные показаны из одного эксперимента.

Обогащение терминов GO, связанных с иммунной функцией в генах с подавленной регуляцией во время коинфекции в присутствии E. faecalis , предполагает, что мы также можем наблюдать дифференциальную экспрессию генов, специфически в генах, связанных с популяциями клеток, отвечающими на CAUTI [19 ]. Чтобы проверить это, мы изучили базу данных проекта Immunological Genome Project (ImmGen), которая включает общедоступные данные из коллекции типов иммунных клеток мышей C57BL / 6J [13, 26].Мы обнаружили, что в топ-50 дифференциально регулируемых генов между моноинфицированными и коинфицированными группами гены, специфичные для дендритных клеток (DC), макрофагов (MF) и моноцитов (MO), были чрезмерно представлены и показали снижение уровней мРНК в коинфицированных животных, что свидетельствует об уменьшении инфильтрации или активации этих клеток в мочевом пузыре после коинфекции по сравнению с моноинфекцией (фиг. 4C, таблица из таблицы S2) .

E. faecalis пределы E.coli -опосредованная активация иммунитета и способствует вирулентности E. coli у смешанных видов CAUTI

Основано на подавлении транскриптов, связанных с регуляцией интерферона ( oas и ifi ) и моноцитарным хемотаксисом (CCL12) во время E. faecalis -опосредованное подавление иммунитета in vivo , мы предположили, что подавление позволяет UPEC лучше колонизировать мочевой пузырь в присутствии E. faecalis . Чтобы проверить это на модели CAUTI, мы со-инфицировали катетеризованных мышей 10 ⁷ КОЕ E.faecalis OG1RF и 10 ⁷ КОЕ E. coli UTI89, и не наблюдали значительных различий в титрах E. coli по сравнению с мономикробной инфекцией E. coli (рис. 5A и 5B) . Напротив, титры E. faecalis во время коинфекции были значительно ниже в мочевом пузыре, но не в почках, что могло быть результатом тканевого тропизма E. faecalis к почкам или увеличения клиренса в результате . Э.coli — вызванная иммунная активация, как описано ранее для E. coli — коинфекции Streptococcus группы B в мочевом пузыре (рис. 5A и 5B) [16, 27]. Мы предположили, что иммуномодулирующая способность штамма UPEC UTI89 может быть достаточной, чтобы вызвать высокий титр CAUTI, так что E. faecalis не может способствовать дальнейшему развитию инфекции [28]. Таким образом, мы предположили, что колонизация непатогенным, комменсалоподобным штаммом E. coli , таким как штамм K12 MG1655, дефицитным по экспрессии О-антигена LPS, может усиливаться за счет E.faecalis -опосредованная иммуномодуляция [29]. Чтобы проверить это, мы заразили катетеризованных мышей только 10 ⁷ E. coli K12 штаммом MG1655 или 10 ⁷ каждой из E. coli вместе с E. faecalis в равных соотношениях. Подобно инфекции UTI89, E. coli КОЕ не различались после коинфекции E. faecalis в мочевом пузыре через 24 часа на дюйм по сравнению с моновидовой инфекцией E. coli и E.faecalis КОЕ были значительно уменьшены (Рис. 5C) . Напротив, КОЕ E. coli были значительно увеличены в почках после коинфекции E. faecalis , тогда как КОЕ E. faecalis не изменились (рис. 5D) . В совокупности эти исследования инфекций показывают, что присутствие иммуномодулирующих организмов, таких как E. faecalis , в контексте полимикробного CAUTI, может повысить патогенность невирулентного инфекционного организма и повысить уязвимость хозяина к инфекции, вызываемой в противном случае комменсалом. организмы.

Рис. 5. E. faecalis способствует заражению E. coli MG1655 при смешанных видах CAUTI in vivo .

Самкам мышей C57BL / 6NTac имплантировали силиконовые катетеры 5 мм в мочевой пузырь и инфицировали 10 ⁷ КОЕ E. coli UTI89 или только MG1655, 10 ⁷ КОЕ E. faecalis только OG1RF или смесь 1: 1 10 ⁷ КОЕ E. coli и 10 ⁷ КОЕ E. faecalis . (A) Титры мочевого пузыря и (B) почек из E.coli UTI89 и E. faecalis , моно- и коинфекция. (C) Титры мочевого пузыря и (D) почек для моно- и коинфекций E. coli MG1655 и E. faecalis . Через 24 часа мочевой пузырь и почки были удалены и подсчитаны КОЕ. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов (5-7 мышей в группе). Прямоугольники представляют 25-й и 75-й процентили, а средняя линия указывает медианное значение. Усы представляют собой минимальное и максимальное значения набора данных. Значимость определялась непараметрическим критерием Манна-Уитни.* P <0,05, ** P <0,01. Пунктирная горизонтальная линия представляет предел обнаружения (LOD) анализа. Титрам ниже LOD было присвоено значение LOD для визуализации в логарифмической шкале и 0 для статистического анализа.

Обсуждение

Иммуномодулирующие функции бактерий могут изменять участки инфекции, что приводит к повышенной восприимчивости к колонизации и персистенции [30, 31]. E. faecalis может усиливать иммунный ответ в различных типах клеток, включая линии клеток кишечного эпителия и макрофагов мыши [14, 15, 30].Недавно было показано, что штаммов E. faecalis V583 и E99 подавляют активацию NF-κB эпителиальных клеток кишечника и макрофагов RAW264.7 при MOI 100 [30]. В отличие от сообщений о высоком уровне иммуносупрессии MOI, инфицирование макрофагов RAW264.7 и макрофагов, происходящих из костного мозга, штаммом E99 E. faecalis при MOI 10 приводит к активации NF-κB [30]. Эти противоречивые сообщения об активации и подавлении NF-κB E. faecalis подчеркивают необходимость дальнейшего исследования E.faecalis иммуномодулирующая активность в макрофагах. Здесь мы разрешаем предыдущие противоречивые отчеты и показываем, что оба штамма E. faecalis V583 и OG1RF предотвращают активность NF-κB в макрофагах RAW264.7 дозозависимым образом.

Несколько факторов вирулентности E. faecalis модулируют иммунитет во время инфекции, включая агрегационное вещество (AS), желатиназу и TcpF [30, 32, 33]. AS способствует фагоцитозу и интернализации в макрофаги посредством взаимодействия с рецептором комплемента 3 типа.После интернализации AS может сопротивляться уничтожению супероксида, что приводит к увеличению выживаемости в макрофагах [34]. Кроме того, желатиназа способствует уклонению от врожденного иммунитета, взаимодействуя с системой комплемента, уменьшая опсонизацию и уменьшая рекрутирование нейтрофилов [32, 33, 35]. TcpF представляет собой белок, содержащий домен TIR, и препятствует взаимодействиям Toll-подобный рецептор (TLR) -MyD88, которые также зависят от взаимодействий, опосредованных доменом MyD88 TIR. В результате экспрессия TcpF E. faecalis приводит к снижению транслокации NF-κB p65 в макрофагах RAW [30, 36].TcpF присутствует в E. faecalis V583 и обогащен изолятами ИМП, но отсутствует в OG1RF [30, 36]. Поскольку мы наблюдали модуляцию NF-κB как E. faecalis, OG1RF, так и V583, TcpF вряд ли является фактором, опосредующим супрессию высокого уровня NF-κB в макрофагах. Вместо этого наши данные предполагают, что фактор E. faecalis , который предотвращает активность NF-κB, представляет собой молекулу, модифицируемую при нагревании. Другие грамположительные патогены секретируют иммуномодулирующие молекулы, модифицируемые при нагревании.Например, суперантиген-подобные белки (SSL) Staphylococcus aureus обладают иммуномодулирующими функциями, такими как ингибирование опосредованных IgA иммунных ответов и нацеливание на нейтрофилы для ограничения прикрепления к эндотелиальным клеткам [37–42]. SSL3 может подавлять TLR2-опосредованную продукцию IL-8 путем конкурентного связывания с лигандами PAMP TLR2 [43]. Наша работа показывает, что E. faecalis может обладать аналогичными секретируемыми факторами, которые модулируют активацию NF-κB и предотвращают клиренс бактерий иммунными клетками хозяина.

Большая часть инфекций E. faecalis являются полимикробными, а E. faecalis часто совместно выделяются с E. coli от инфекций мочевыводящих путей и ран [25, 31, 44-46]. Учитывая преобладание E. faecalis в полимикробных взаимодействиях, мы провели экспериментов in vitro и in vivo для изучения вклада E. faecalis в исходы коинфекции. Мы обнаружили, что E. faecalis предотвращал активность NF-κB во время коинфекции живыми E.coli K12 штамм MG1655 и UPEC UTI89 in vitro и увеличил титры E. coli K12 штамма MG1655 в почках. Подобно результатам нашего исследования, грамположительные уропатогены Staphylococcus saprophyticus и Streptococcus группы B вызывают минимальные провоспалительные реакции в мочевыводящих путях, а последний ограничивает патогенез UPEC у мышей [27, 31, 47-49] . Взятые вместе, наши результаты показывают, что модуляция иммунного ответа E. faecalis может способствовать выживанию сопутствующих патогенов, что приводит к более тяжелой инфекции.

Синергетические полимикробные инфекции все чаще признаются за их вклад в тяжесть и постоянство болезни [21, 31]. Здесь мы показываем, что E. faecalis модулировал ответ хозяина и способствовал инфицированию штаммом E. coli , который в остальном не является вирулентным. Важно отметить, что наличие E. faecalis в мочевыводящих путях, особенно при низких титрах, исторически считалось комменсальным контаминантом сомнительной патогенной значимости [50].Наши результаты ставят под сомнение это предположение и повышают вероятность того, что E. faecalis не только усиливает инфекций E. coli , но также может способствовать заражению более широким спектром уропатогенов. Необходимы постоянные усилия по анализу этих полимикробных молекулярных взаимодействий, чтобы обеспечить лучшую диагностику и прецизионное лечение, особенно с учетом того, что патогены ИМП становятся все более устойчивыми к антибиотикам последней инстанции [51].

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста

Уропатогенные E.coli (UPEC), штамм UTI89 [52, 53] и E. coli K12, штамм MG1655 [54], выращивали в течение ночи в бульоне Лурия-Бертани (LB) или на агаре при 37 ° C в статических условиях. E. faecalis штамм OG1RF [55] или V583 [56] выращивали в статическом режиме в бульоне для инфузии мозга и сердца (BHI) или агаре при 37 ° C в течение ночи. Ночные культуры бактерий центрифугировали при 6000 g в течение 5 минут и ресуспендировали в PBS при OD ₆₀₀ 0,7 (2 x 10 ⁸ КОЕ / мл) для E.faecalis и OD ₆₀₀ 0,4 (2 x 10 ⁸ КОЕ / мл) для E. coli .

Клеточная культура

Клетки RAW-Blue, полученные из макрофагов RAW 264.7 (Invivogen), содержащие плазмиду, кодирующую репортер секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) под транскрипционным контролем NF-κB-индуцируемого промотора, культивировали в модифицированном Dulbecco Eagle. среда, содержащая 4500 мг / л глюкозы (1X) с 4,0 нМ L-глутамина, без пирувата натрия (Gibco) и с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS; PAA) с добавлением 200 мкг / мл зеоцина при 37 ^° ° C в 5% CO ₂ .

Инфекция макрофагов RAW-Blue

Клетки RAW-Blue высевали в 96-луночный планшет из расчета 100000 клеток / лунку в 200 мкл среды для культивирования клеток, не содержащей антибиотиков. После инкубации в течение ночи клетки один раз промывали PBS и добавляли свежую среду. Репортерный анализ SEAP был установлен путем эмпирического определения минимальной концентрации агониста (липополисахарида (LPS) или липотейхоевой кислоты [57]), которая индуцировала максимальную активность SEAP в отсутствие гибели клеток. Клетки стимулировали с использованием сверхчистого LPS EB, очищенного из E.coli O111: B4 (Invivogen) (100 нг / мл) или LTA, полученный / очищенный из Staphylococcus aureus (Invivogen) (100 нг / мл) в качестве положительного контроля, или только среда в качестве отрицательного контроля. Клетки RAW-Blue инфицировали E. faecalis (при MOI 100: 1, 50: 1, 25: 1, 10: 1 и 1: 1) в течение 6 часов с агонистами TLR или без них. Ночные бактериальные культуры центрифугировали и ресуспендировали в среде для культивирования клеток. Для экспериментов по заражению живые бактериальные культуры разводили для достижения желаемой множественности заражения макрофагами (MOI).Альтернативно, бактерии умерщвляли нагреванием (80 ° C в течение 1 часа) перед добавлением в культуры макрофагов. Для экспериментов с коинфекцией клетки RAW-Blue одновременно инфицировали штаммом E. coli K12 MG 1655 (MOI 1: 1) или E. coli UTI89 (MOI 0,125: 1) и E. faecalis OG1RF. (MOI 100: 1, 50: 1, 25: 1, 10: 1 и 1: 1). Убитые нагреванием бактерии проверяли по отсутствию жизнеспособных бактерий при посеве на агар BHI.

Сбор бактериальных супернатантов бесклеточной культуры

Бактерии выращивали в среде для культивирования клеток в течение 6 часов, и свободные от бактерий культуральные супернатанты собирали после центрифугирования (6000 г ) с последующей фильтрацией (с использованием 0.Шприцевой фильтр 2 мкм). Альтернативно, супернатанты собирали после заражения макрофагов бактериями с различными MOI, а затем фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,2 мкм. Стерильность свободных от бактерий культуральных супернатантов проверяли по отсутствию жизнеспособных бактерий при посеве на агар BHI.

Репортерный анализ NF-κB

После инфицирования 20 мкл супернатанта добавляли к 180 мкл реагента QUANTI-Blue (Invivogen) и инкубировали в течение ночи при 37 ^{° C.} C. Уровни SEAP определяли при 640 нм с использованием TECAN. Считыватель микропланшетов M200.Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Анализ жизнеспособности клеток

Одновременно со сбором супернатанта для определения SEAP, культуральный супернатант собирали из каждой лунки для измерения высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с использованием анализа цитотоксичности ЛДГ (Clontech) в соответствии с инструкциями производителя. Фоновую активность ЛДГ определяли с использованием ложных (PBS) обработанных клеток RAW-Blue. Максимальную активность ЛДГ определяли лизированием клеток 0,2% тритоном-X. Каждое условие было выполнено в трех экземплярах.Процент цитотоксичности рассчитывали следующим образом: (абсорбция образца — фоновая абсорбция) / (максимальная абсорбция — фоновая абсорбция) x 100.

Анализ Luminex MAP

Супернатанты собирали из клеток RAW-Blue через 6 часов после инфицирования и хранили при -80 ° C до оценки с помощью набора для анализа мышиного цитокина 23-plex Bio-Plex Pro (Bio-Rad Laboratories) в соответствии с рекомендациями производителя [58]. Все образцы оценивались с использованием одной и той же партии набора и в одно и то же время, чтобы избежать вариабельности между анализами.

Катетеризация и бактериальные инфекции

Эксперименты на мышах были выполнены с этического одобрения Комитетом по уходу и использованию животных Технологического университета ARF-SBS / NIE Nanyang в соответствии с протоколом ARF-SBS / NIE-A0247. Катетеры имплантировали в мочевой пузырь мышей с последующей инокуляцией бактерий через трансуретральный катетер, как описано ранее [18, 59]. Вкратце, самок мышей C57BL / 6NTac в возрасте 6-8 недель (InVivos Pte Ltd, Сингапур) анестезировали изофлураном (4%).Объем инокулята 50 мкл, содержащий бактериальную суспензию отдельных или полимикробных видов, приготовленную в PBS: (i) 10 ⁷ КОЕ штамма E. coli K12 MG1655 с 10 ⁷ КОЕ E. faecalis OG1RF, и (ii) 10 ⁷ КОЕ E. coli UTI89 с 10 ⁷ КОЕ E. faecalis OG1RF. Контроль отдельных видов (10 ⁷ КОЕ E. coli K12, штамм MG1655, 10 ⁷ КОЕ E. faecalis OG1RF или 10 ⁷ КОЕ E.coli UTI89) проводились параллельно с полимикробными инфекциями. Животных умерщвляли вдыханием диоксида углерода и смещением шейки матки, мочевые пузыри и почки удаляли в асептических условиях и гомогенизировали в 1 мл PBS для подсчета КОЕ путем серийных разведений на агаре МакКонки или агаре BHI с добавлением 10 мкг / мл колистина и 10 мкг / мл налидиксовой кислоты для изолят E. coli или E. faecalis соответственно. Для определения видов бактерий, отличных от инокулированных E.coli или E. faecalis , серийные разведения также высевали на LB и BHI. Данные объединены из 2 независимых экспериментов (5-7 мышей в группе). Животные без катетеров на момент умерщвления не включались в анализ.

РНК-секвенирование инфицированных мочевых пузырей

Катетеризованных мышей инфицировали, как описано выше, 10 ⁷ E. coli UTI89 или смешивали в соотношении 1: 1 с 10 ⁷ E. faecalis OG1RF, в 50 мкл PBS.Через 24 часа целые мочевые пузыри удаляли и инкубировали в течение ночи в RNAlater (Qiagen), чтобы обеспечить полное проникновение в ткань протектора перед хранением при -80 ° C. РНК экстрагировали, как описано [60]. Для каждого условия образца было сконструировано всего три библиотеки секвенирования из 50-200 нг РНК-истощенной рРНК. 2 нМ каждой библиотеки объединяли в равных объемах и секвенировали, используя Illumina Hiseq®2500 v.2 (Illumina), 150 пар оснований на конце.

Анализ секвенирования РНК

Данные секвенирования доступны в BioProject NCBI (инвентарный номер.PRJ-NA335539). Результаты секвенирования РНК анализировали, как описано в [19]. Вкратце, было проверено качество чтения, а адаптеры обрезаны с помощью cutadapt-1.4.1 с использованием параметров по умолчанию. Геном мыши mm10 использовался в качестве эталона для tophat-2.0.11.Linux_x86_64 [61] и счетчиков транскрипционных считываний, полученных с использованием HTSeq-0.6.1 [62] с параметрами по умолчанию с нецепочечным анализом. Если не указано иное, все дальнейшие анализы проводились в среде статистических вычислений R (версия 3.3.3) [63]. Дифференциальный анализ E.coli моновидовых инфицированных животных до E. coli и E. faecalis , коинфицированных OG1RF животных, выполняли с использованием пакета R / Bioconductor DESeq2 (версия 1.40.1) [64]; используя настройки по умолчанию из этого пакета. NCBI-файл gene2refseq (загруженный 03.03.2016) использовался для преобразования Refseq в идентификаторы Entrez для дальнейшего анализа аннотаций генной отологии и данных проекта иммунологического генома (ImmGen) для функционального анализа.

Функциональный анализ транскриптома мочевого пузыря

Обработка данных экспрессии ImmGen выполнялась в R 3.2.2 [63]. Вкратце, все 681 файл CEL [65] был обработан с использованием метода RMA с пакетом oligo R / Bioconductor (версия 1.34.0). Аннотация была сделана с использованием пакета R / Bioconductor mogene10sttranscriptcluster.db (версия 8.4.0) с профилями экспрессии для каждой иммунной клетки, указанными в Jojic et al. Оценка накопления была рассчитана для каждого типа иммунных клеток [66] и исследована дифференциально экспрессируемые гены в верхнем 1% распределения оценок для каждого типа клеток, и они сравнены с когортами одинакового размера случайно выбранных генов (таблица S3).Этот анализ проводился отдельно в наборах генов с повышенной и пониженной регуляцией при сравнении двух групп. Онтологический анализ выполнялся с использованием пакета GO.db R / Bioconductor (версия 3.4.0) и файла gene2go из базы данных NCBI Gene (загружен 03.03.2016) с использованием модифицированного кода из пакета R / Bioconductor onTools (версия 1.28. 0) [67]. Чтобы проверить, связаны ли дифференциально экспрессируемые гены с конкретными наборами генов, мы построили таблицы сопряженности 2 на 2 и категоризировали гены в зависимости от того, экспрессируются ли они по-разному или нет, для каждого включенного термина биологического процесса онтологии генов.Случайное присвоение было проверено с помощью точного критерия Фишера [68] и исправлено на количество терминов с помощью поправки Бенджамини-Хохберга [69]. Мы отфильтровали термины, используя их информационное содержание (IC) , [70], на основе их частоты встречаемости от 3 до 4, в результате получили набор из 157 включенных терминов, которые представляют соответствующий компромисс между общим количеством включенных терминов. и специфика функционального понимания. Весь рабочий процесс R и файлы входных данных доступны в Интернете (https: // github.com / rbhwilliams / Kline-polymicrobial -fection-paper).

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6.05 для Windows, Калифорния, США). Анализы SEAP были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с множественным сравнением Тьюки. Показания цитокинов для анализа Luminex MAP анализировали с помощью теста Краскела-Уоллиса. Титры КОЕ сравнивали с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. P — значения менее 0,05 считались значимыми.Сравнение цитокинов проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни, а дальнейшее сравнение выполняли с использованием анализа главных компонентов в R (версия 3.3.2) с пакетами factoextra (версия 1.0.4) и FactoMineR (версия 1.34). Данные тепловой карты отражают преобразование необработанных данных в журнал ₂ и отображаются в R (версия 3.3.2) с использованием пакета R, pheatmap (версия 1.0.8).

Благодарности

Мы благодарим Критику Арумугам за ее помощь в обработке данных о последовательностях.Эта работа была основана на данных, собранных Консорциумом ImmGen [26]. BYQT, HMSG, KKLC, SBT SH, RBHW и KAK были поддержаны Национальным исследовательским фондом и Министерством образования Сингапура в рамках программы исследовательского центра передового опыта.